LC-MS/MS检测猪肉中氯米芬残留

本实验使用岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用系统，建立了猪肉中氯米芬残留量的检测方法。该方法具有较好的检出限、精密度和回收率，且样品前处理操作简单，分析速度快，可以为检测动物源性食品中氯米芬的残留量提供参考。SSL-CA23-222 Excellence in ScienceLCMSMS-792 LC-MS/MS 检测猪肉中氯米芬残留 LCMSMS-792 摘要：本文依据《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》建立了一种使用岛津三重四极杆液质联用仪测定猪肉中 氯米芬残留量的方法，样品经甲醇提取， MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。结果显示：氯米芬在0.2~100 ng/mL 浓度范围内线性良好，校准曲线相关系数大于0.999；精密度实验中，0.2、2、50 ng/mL 的标准溶液，重复测定6次，保留时间 RSD 不大于0.13%，峰面积 RSD 不大于 3.00%。该方法操作简单、特异性好、灵敏度高、分析速度快，可为动物源性食品中氯米芬的残留量检测提供参考。 关键词：三重四极杆液质联用仪兴奋剂猪肉 氯米芬 技术特点： 心本方法检测灵敏度优于《指南》中规定肉制品中氯米芬检出限2 ug/kg 的要求。 心本方法采用抗干扰能力更强的 LCMSMS 法进行测定，整个分析时间仅 5 min， 高效稳定。 氯米芬(Clomiphene)，化学名称为 N，N-二乙 基-2-[4-(1，2-二苯基-2-氯乙烯基)苯氧基]乙胺，分 子式为 C26H28CINO， 由于化学稳定性比较差，通常以 枸橼酸盐形式存在。氯米芬具有较强的抗雌激素作用 和较弱的雌激素活性，临床上主要用于避孕药引起的 闭经及月经紊乱。若食品中残留该物质或机体摄入量 过多会导致内分泌絮乱，严重影响生育及胎儿的健康。 国家体育总局于2021年发布了《大型赛事食源 性兴奋剂防控工作指南》，要求大型赛事举办方对肉 食品中食源性兴奋剂进行检测，其中氯米芬参考检出 限2ug/kg。 目前，氯米芬的检测方法主要是液相色谱法，暂 未有文献报道使用液相色谱串联质谱进行测定，且动 物源性食品基质的研究也尚未见报道。 本文采用液相色谱-串联质谱，建立了猪肉、中 氯米芬残留的检测方法，该方法快速、准确、灵敏度高，可实现对肉制品中氯米芬残留的有效检测，为相关行 业提供参考。 实验部分 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统LCMS-8050。具体配置为： 输 液 泵LC-30AD×2系统控制器：：CBM-20A 自动进样器SIL-30AC质 谱 仪：LCMS-8050柱 温 箱CTO-20AC色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.114 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 ((.50 mm x2.1mml.D.，1.9 um)， 岛津(上海))实验器材有限公司， P/N： 227-30048-02 流动相A 相-0.1%甲酸水溶液；B相-甲醇击·流 柱 速0.3mL/min 温 品： 40°C 进样 量： 2uL 洗脱方式： 梯度洗脱，初始 40%B 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 40 1.00 Pumps Pump B Conc. 80 2.50 Pumps Pump B Conc. 80 2.60 Pumps Pump B Conc. 40 5.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪：LLCMS-8050 DL管温度：250°℃离子源：ESI+ 加热模块温度： 400°C雾化气：氮气 3L/min 接口/温度：300℃干燥气：舞氮气 10 L/min 扫描模式：：MRM 加热气：空气 10 L/min MRM参 数：见表2 2MRM 参数 中文名 英文名 CAS# 前体离子 (m/z) 产物离子 (m/z) Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 氯米芬 Clomiphene 100.10* -15.0 -25.0 -18.0 50-41-9 406.19 58.00 -15.0 -44.0 -10.0 72.10 -15.0 -34.0 -13.0 *表示定量离子对 1.3主要标准品和耗材 标准品：氯米芬，购于岛津(上海)实验器材有限公司， PN： 380-04457-53，。 MCX 固相萃取柱：规格150mg， 6mL， 购于岛津(上海)实验器材有限公司， PN： 380-00853-07。 1.4样品前处理方法 准确称取2g左右试样置于50 mL 离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋l min， 超声 30 min， 4000 r/min 离心 5 min， 转移上清液于另一具塞试管中。再加入10mL甲醇，重复上述操作，合并2次上清液，并用甲醇定容到 25mL，涡旋混匀，备用。依此用甲醇5mL，水5mL活化 MCX 固相萃取柱。准确移取上述试液 12.5 mL 上柱，液体的过柱速度控制在1 mL/min 以内，并依次用2%乙酸溶液5mL、甲醇5mL淋洗柱子，用5%氨水甲醇5mL洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干。准确加入1mL甲醇溶解残留物，涡旋30 s， 过 0.22 um有机滤膜，上液 相色谱串联质谱分析。 1.5标准溶液的制备 标准系列工作液的配制：吸取适量混合标准中间工作液，用40%甲醇水稀释定容，配制成浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL 的标准工作溶液，上液相色谱串联质谱分析。 ■结果与讨论 2.1标准溶液的 MRM 色谱图 浓度为 0.2 ng/mL 氯米芬标准品的 MRM 色谱图如图1所示。 图1 空白样品和 0.2 ng/mL氯米芬标准品的 MRM 色谱图 图2 氯米芬的校准曲线 2.2线性范围 按照1.5方法配制标准系列溶液，上机分析，采用外标法绘制氯米芬校准曲线。结果表明：氯米芬在0.2~100ng/mL范围内，线性良好，校准曲线方程为Y=282225.8X-39335.17，相关系数R为0.9999，准确度94.5%~114.4%之间。通过 LabSolutions 软件依据信噪比 (ASTM) 自动计算，氯米芬检出限(S/N=3) 为0.02 ng/mL， 定量限(S/N=10)为 0.06 ng/mL， 氯米芬校准曲线见图2。 2.3精密度考察 取 0.2、2、50 ng/mL的标准溶液，平行测定6次，计算保留时间 (R.T.)和峰面积 (Area) 的 RSD。结果显 示氯米芬的保留时间的 RSD 不大于 0.13%， 峰面积的 RSD 不大于3.00%，仪器精密度好。 表3 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 RSD% (0.2ng/mL) RSD% (2ng/mL) RSD% (50ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 氯米芬 0.12 3.00 0.13 1.00 0.06 1.00 2.4加标回收率 选择空白猪肉，进行 0.50、1.00、3.00 ug/kg 浓度的加标回收试验，每个加标浓度3个平行，按照前述前处 理方式处理，上机测定，以校准曲线法定量，计算回收率。氯米芬加标回收率在 82.0%~106.0%之间，符合《大 型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》要求。 表4氯米芬加标回收率结果(n=3) 基质 检出浓度 加标浓度 测得浓度 回收率 RSD (ug/kg) (ug/kg) (ug/kg) (%) (%) 0.50 0.41 82.0 1.57 猪肉 N.D. 1.00 0.89 89.0 1.42 3.00 3.05 105.0 1.95 注：N.D.表示未检出 结论 本实验使用岛津 LCMS-8050 三重四极杆液质联用系统，建立了猪肉中氯米芬残留量的检测方法。该方法具 有较好的检出限、精密度和回收率，且样品前处理操作简单，分析速度快，，可以为检测动物源性食品中氯米芬 的残留量提供参考。 岛津应用云