荷斯坦奶牛产前与产后饲粮中蛋白质、脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的检测

过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响动物营养学报２０１９，３１（７）：３１４３⁃３１５５Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ 动 物 营 养 学 报４４１３３１卷 ｄｏｉ ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１９．０７．０２５ 过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和 黏膜代谢及免疫相关基因表达的影响 张小丽 １，２ 吴 建 １，２ 韩雪峰 １ 谭支良 １ 焦金真 １∗ （１．中国科学院亚热带农业生态研究所 ，亚热带农业生态过程重点实验室 ，畜禽养殖污染控制与资源化技术 国家工程实验室 ，湖南省畜禽健康养殖工程技术中心 ，农业部中南动物营养与饲料科学观测实验站 ，长沙 ４１０１２５；２．中国科学院大学 ，北京 １０００４９） 摘 要 ：本试验旨在探究过瘤胃葡萄糖对围产期奶牛空肠微生物群落和黏膜代谢及免疫相关 基因表达的影响 。选择 １０头围产期荷斯坦奶牛 ［４～５岁 、体重 （５１５±４２） ｋｇ ］随机分为 ２组 ，每 组 ５头 。对照组和过瘤胃葡萄糖组奶牛饲喂相同的基础饲粮 ，同时对照组每头每日给予 ９０ ｇ 过 瘤胃脂肪 ，过瘤胃葡萄糖组每头每日给予 ２００ ｇ 过瘤胃葡萄糖 。预试期 １４ ｄ （产前第 ２１天到产 前第 ８天 ），正试期 ２１ ｄ （产前第 ７天到产后第 １４天 ）。正式期结束后 ，将所有奶牛 （１０头 ）屠宰 并取空肠食糜样品 ，测定其中挥发性脂肪酸的含量和微生物群落 ；同时取空肠黏膜样品 ，进行代 谢及免疫相关基因表达分析 。结果显示 ：与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄糖有降低空肠食糜中 总挥发性脂肪酸含量的趋势 （Ｐ ＝０．０９４）。与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄糖有上调空肠黏膜中 葡萄糖转运蛋白 ４（ＧＬＵＴ ４）表达量的趋势 （Ｐ ＝０．０６３），有下调 Ｔｏｌｌ 样受体 ４（ＴＬＲ ４）（Ｐ ＝０．０６３）、白细胞介素 －１７Ａ （ ＩＬ ⁃１７Ａ ）（Ｐ ＝０．０６３）和白细胞介素 －２６（ ＩＬ ⁃２６）（Ｐ ＝０．０６３）表达量的 趋势 ，同时显著性地上调了丙酮酸羧化酶 （ＰＣ ）（Ｐ ＝０．０１６）、闭合蛋白 （ｏｃｃｌｕｄｉｎ ）（Ｐ ＝０．０１６）和 胰岛素生长因子结合蛋白 ５（ ＩＧＦＢＰ ５）（Ｐ ＝０．０３２）的表达量 ，显著性地下调了白细胞介素 －２２（ ＩＬ ⁃２２）（Ｐ ＝０．０１６）、基质金属蛋白酶 １（ＭＭＰ １）（Ｐ ＝０．０１６）和基质金属蛋白酶 ９（ＭＭＰ ９）（Ｐ ＝０．０３２）的表达量 。此外 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄糖显著性地增加了空肠食糜中梭菌属 ⅪⅤ子集的数量 （Ｐ ＝０．０３６）。由此可见 ，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖可以改善葡萄糖 在机体的代谢以及提高免疫力 ，同时促进免疫相关有益菌梭菌属 ⅪⅤ子集的定植 ，从而缓解围 产期能量负平衡导致的不良影响 。 关键词 ：围产期 ；奶牛 ；空肠 ；基因表达 ；代谢 ；免疫 ；微生物 中图分类号 ：Ｓ８１６ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１００６⁃２６７Ｘ （２０１９）０７⁃３１４３⁃１３ 围产期是指产前 ３周到产后 ３周的这一段时 间 ［１］，为了机体适应分娩和分泌乳汁 ，奶牛的内分 泌和代谢在这一时期会发生巨大的变化 ［２］。在奶 牛养殖中围产期是一个既特殊又关键的时期 ，它 的饲养管理决定了奶牛整个泌乳期的产奶量和健 康状况 ［３］。由于干物质采食量的下降以及泌乳早 期对能量需求的激增导致机体处于能量负平衡状 态 ［４－５］。此时 ，奶牛出现血液中葡萄糖和胰岛素含 量降低 ，胰高血糖素含量增加 ，激素敏感脂酶活性 下降 ，机体动员体脂 ［６－７］，释放出游离脂肪酸 （ＮＥＦＡ ）进入循环并且转移至肝脏 ，导致脂肪肝等 疾病发生 ［３］。除此之外 ，由于分娩应激和氧化应 收稿日期 ：２０１８－１２－２９ 基金项目 ：国家重点研发计划项目 （２０１６ＹＦＤ０５０１２０６）；湖南省科技重大专项项目 （２０１７ＮＫ１０２０） 作者简介 ：张小丽 （１９９３—），女 ，重庆人 ，硕士研究生 ，从事反刍动物营养研究 。 Ｅ⁃ｍａｉｌ ： １０１２９７２８２５＠ｑｑ．ｃｏｍ ∗通信作者 ：焦金真 ，副研究员 ，Ｅ⁃ｍａｉｌ ： ｊｊｚ＠ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ 激 ，奶牛的免疫力下降 ，产后发病率极高 ，其中包 括乳房炎 、子宫内膜炎 、产后败血症等 ，不利于奶 牛产后生产性能和繁殖性能的发挥 ，严重影响奶 牛养殖的经济效益 ［８］。为了缓解能量负平衡对动 物的损害 ，调控围产期奶牛的营养 ，研究学者们进 行了一系列的工作 ，主要方法有调整围产后期饲 粮能量水平 、增加饲粮脂肪水平 、使用饲料添加剂 等 ［９］。 ２００７年 ，Ｇｕｏ 等 ［１０］将产前饲粮的能量水平 提高至产后饲粮的能量水平 ，但是结果显示不但 没有提高产后的生产性能 ，反而加剧了奶牛的脂 质动员 ，更容易导致奶牛发生酮病 。随后 ，Ｊａｎｏｖ⁃ｉｃｋ 等 ［１１］发现降低产前饲粮能量水平可以轻微缓 解奶牛围产期各种变化对奶牛生产性能的影响 ，但是效果不明显 。近年 ，有报道称 ，瘤胃保护烟酸 可以抑制脂肪分解 ，降低牛奶能量输出 ，改善转型 奶牛产后能量平衡 ［１２］，这与代谢组学得出的补充 烟酰胺可以改变不饱和脂肪酸代谢 、减轻氧化应 激 ［１３］的结果一致 。另有研究发现 ，在奶牛饲粮中 添加瘤胃不可降解蛋白质 ［１４］或脂囊化共轭亚油 酸 ［１５］可以提高繁殖性能乙基纤维素包被的过瘤胃 蛋氨酸可以提高奶牛的产奶量 ，减轻炎症和氧化 应激 。但是 ，目前缓解负能量平衡 、提高产乳性能 的途径还不统一 ，需要解决的关键是围产期的葡 萄糖代谢 。 葡萄糖对于奶牛合成牛奶是必不可少 的 ［１６－１７］，其在小肠内摄取和吸收之后转换成能量 比微生物发酵生成 ＶＦＡ 更加有效 ［１８］。研究发现 ，十二指肠注射葡萄糖的泌乳奶牛与注射等能 ＶＦＡ 的泌乳奶牛相比 ，产奶量和乳蛋白含量都得到了 提高 ［１９］。因此 ，了解肠道内葡萄糖的吸收和代谢 是维持围产期奶牛健康 、提高性能和生产力的关 键 。葡萄糖主要是通过钠依赖转运载体 ———钠 －葡萄糖协调转运蛋白 １（ＳＧＬＴ１）、钠 －葡萄糖协调 转运蛋白 ３（ＳＧＬＴ３）和非依赖钠转运载体 ———葡 萄糖转运蛋白 ２（ＧＬＵＴ２）、葡萄糖转运蛋白 ５（ＧＬＵＴ５）的主动转运进入肠上皮细胞被吸 收 ［２０－２１］。肠上皮细胞与机体免疫密切相关 ，研究 表明 ，围产期肠上皮细胞发生了形态学上的变化 ，这些变化是免疫相关基因和生长因子相互作用的 结果 ［２２］。肠道微生物区系受饲粮的影响 ，其同时 也会影响机体对营养物质的消化吸收 。研究发 现 ，肠道黏膜先天免疫功能与微生物多样性之间 有着密切的联系 ［２３］。但是目前国内针对围产期奶 牛补饲葡萄糖对肠道微生物群落及免疫和代谢相 关基因表达的研究鲜有报道 。因此 ，本试验通过 给围产期奶牛补饲过瘤胃葡萄糖 ，研究其对围产 期奶牛空肠发酵参数 、微生物群落以及黏膜代谢 与免疫相关基因表达的影响 ，以期为过瘤胃葡萄 糖在围产期奶牛养殖中的应用提供理论依据 。 １ 材料与方法 １．１ 试验设计 随机选择体重 ［（５１５±４２） ｋｇ ］相近 、年龄 （４～５岁 ）相仿的荷斯坦奶牛 １０头 ，随机分成 ２个组 ，每组 ５头 。对照组和试验组奶牛饲喂相同的饲 粮 ，同时对照组奶牛每头每日给予 ９０ ｇ 过瘤胃脂 肪 （软脂酸 ），而试验组奶牛每头每日给予 ２００ ｇ 过瘤胃葡萄糖 （用脂肪包被 ，９０ ｇ 软脂酸 ＋９０ ｇ 葡 萄糖 ＋２０ ｇ 水 ）。奶牛产前与产后饲粮组成及营养 水平见表 １。预试期 １４ ｄ （产前第 ２１天到产前第 ８天 ），正试期 ２１ ｄ （产前第 ７天到产后第 １４天 ）。试验期间奶牛每日喂料 ２次 ，自由采食 ，自由饮 水 ，１０头奶牛在正试期结束后全部屠宰 。 １．２ 样品采集 奶牛屠宰按照国家标准 ＧＢ １２６９４—２０１６中 方法进行 ，宰前空腹 ２４ ｈ 后 ，颈部放血致死 ，屠宰 后立即无菌操作取出空肠中段食糜 ，其中 ２００ ｍｇ 左右的食糜经液氮速冻后存于 －８０ ℃，用于肠道 微生物 ＤＮＡ 的提取及后期分析 ，剩下的部分取约 １．５ ｇ 左右加入 １５０ μ Ｌ ２５％（质量体积分数 ）的偏 磷酸 ，离心 （４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ｍｉｎ ，１０ ｍｉｎ ）后取上清 液 ，－２０ ℃保存 ，用于测定挥发性脂肪酸含量 。将 肠道中内容物去除干净后 ，用生理盐水和磷酸盐 缓冲溶液 （ＰＢＳ ，ｐＨ＝７．４）冲洗几次 ，然后用无菌的 载玻片刮取 ２份黏膜样品 ，液氮速冻 ，存于 －８０ ℃用于空肠黏膜附着微生物 ＤＮＡ 的提取和组织 ＲＮＡ 的提取 。 １．３ 空肠食糜中挥发性脂肪酸含量的测定 将解冻后的上清液 ４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ ，然后将上清液转移至上样瓶内 ，参照 Ｗｕ 等 ［２４］的方法通过气相色谱仪测定空肠食糜中挥发 性脂肪酸的含量 ，并计算总挥发性脂肪酸的含量 及各组分占总挥发性脂肪酸的比例 。 １．４ 空肠黏膜代谢及免疫相关基因表达的测定 １．４．１ 总 ＲＮＡ 提取和 ｃＤＮＡ 的合成 采用 ＴＲＩｚｏｌ 试剂 （ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司 ，美国 ）从空 肠黏膜中提取总 ＲＮＡ ，之后用琼脂糖凝胶电泳和 ＮＤ－１０００超微量紫外分光光度计测定所提取的总 ＲＮＡ 的质量和浓度 。随后用 ＴａＫａＲａ 公司的 Ｐｒｉｍｅ⁃Ｓｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ，按照操 作手册反转录为 ｃＤＮＡ 。将反转录产物置于 －２０ ℃保存备用 。 表 １ 奶牛产前与产后饲粮组成及 营养水平 （干物质基础 ） Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｄｉｅｔｓ ｆｏｒ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ ｉｎ ｐｒｅｐａｒｔｕｍ ａｎｄ ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ （ＤＭ ｂａｓｉｓ ） ％ 项目 产前 产后 Ｉｔｅｍｓ Ｐｒｅｐａｒｔｕｍ Ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ 原料Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ 玉米青贮Ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ ２４．７０ ３０．２０ 燕麦秸 Ｏａｔ ｈａｙ ５５．３０ １２．８０ 苜蓿干草 Ａｌｆａｌｆａ ｈａｙ １７．１０ 玉米 Ｃｏｒｎ ５．９０ ７．００ 麦麸 Ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ９．１０ ２１．３０ 豆粕 Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ （４９％ ＣＰ） ４．１０ ８．０７ 碳酸钙 ＣａＣＯ３ ０．２３ １．１３ 磷酸氢钙 ＣａＨＰＯ４ ０．２３ ０．４５ 食盐 ＮａＣｌ ０．１６ ０．４５ 碳酸氢钠 ＮａＨＣＯ３ ０．６８ 氧化镁 ＭｇＯ ０．０５ ０．０９ 氯化钾 ＫＣｌ ０．３２ 预混料 Ｐｒｅｍｉｘ１） ０．２３ ０．４１ 合计 Ｔｏｔａｌ １００．００ １００．００ 营养水平 Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ２） 粗蛋白质 ＣＰ １１．６ １４．６ 粗脂肪 ＥＥ ２．０ ２．１ 淀粉 Ｓｔａｒｃｈ １０．３ １４．８ 中性洗涤纤维 ＮＤＦ ５３．６ ４５．２ 酸性洗涤纤维 ＡＤＦ ３１．３ ２５．５ 粗灰分 Ａｓｈ ６．８ ６．０ 钙 Ｃａ ０．５０ ０．９８ 磷 Ｐ ０．４１ ０．５４ 产奶净能 ＮＥＬ ／（ＭＪ／ｋｇ） ５．４４ ５．７３ １）预混料为每千克产前饲粮提供 Ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｔｕｍ ｄｉｅｔ ，ｐｒｅｍｉｘ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｅｒ ｋｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｅｔ ：Ｃｕ ９００ ｍｇ ，Ｚｎ １ ３５０ ｍｇ ，Ｍｎ １ ０００ ｍｇ ，Ｃｏ １３ ｍｇ ，Ｉ ２７ ｍｇ ，Ｓｅ ２３ ｍｇ ，ＶＡ ４５０ ０００ ＩＵ ，ＶＤ３１１０ ０００ ＩＵ ，ＶＥ５ ４００ ＩＵ 。预混料为每 千克产后饲粮提供 Ｆｏｒ ｐｏｓｔｐａｒｔｕｍ ｄｉｅｔ ， ｐｒｅｍｉｘ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｅｒ ｋｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｅｔ ：Ｃｕ ３ ０４０ ｍｇ ，Ｆｅ ３ １７０ ｍｇ ，Ｚｎ １４ ２８０ ｍｇ ，Ｍｎ ３ ０６０ ｍｇ ，Ｃｏ ４０ ｍｇ ，Ｉ １８０ ｍｇ ，Ｓｅ １００ ｍｇ ，ＶＡ ２５０ ０００ ＩＵ ，ＶＤ３ ３ ２７０ ０００ ＩＵ ，ＶＥ ５ ０００ ＩＵ 。 ２）营养水平为实测值 。 Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｖａｌｕｅｓ． １．４．２ 基因表达量的定量 荧光定量 ＰＣＲ 在 Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ⅱ序列检测 系统 （Ｒｏｃｈｅ 公司 ，瑞士 ）中进行 ，按照 ＴａＫａＲａ 定 量试剂盒说明书推荐的体系和条件进行反应 。反 应体系为 ：ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ荧光染料预混试剂 ５ μ Ｌ ，ＲＯＸ ０．２ μ Ｌ ，上 、下游引物 （１０ μ ｍｏｌ／Ｌ ）各 ０．２ μ Ｌ ， ｃＤＮＡ 模板 １ μ Ｌ ，灭菌双蒸去离子水 ３．４ μ Ｌ 。反应程序为 ：９５ ℃预变性 ３０ ｓ ；９５ ℃变性 ５ ｓ ，６０ ℃退火和延伸 ３０ ｓ 并采集荧光信号 ，共 ４０个循环 ；按仪器操作说明选择熔解曲线分析 ，６０ ℃升至 ９５ ℃１５ ｓ ，６０ ℃１５ ｓ 、９５ ℃１５ ｓ ，自动采集荧 光 。同时 ，每对引物均设置相应的无模板阴性对 照 （ＮＴＣ ）和无聚合酶污染对照 （ＮＡＣ ）。以 β －肌 动蛋白 （β ⁃ａｃｔｉｎ ）和 ３－磷酸甘油醛脱氢酶 （ＧＡＰ⁃ＤＨ ）为参比基因 ，按照 ２－ΔΔ Ｃｔ 法计算目的基因的表 达量 ，结果以差异变化 （ＦＣ ）表示 ［２５］。用于黏膜基 因表达的引物序列信息见表 ２。 １．５ 空肠微生物的定量分析 １．５．１ 微生物 ＤＮＡ 的提取 空肠食糜微生物 ＤＮＡ 的提取采用 ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ 公司 ，德国 ）。为了尽 可能获得革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的总 ＤＮＡ 同时又不影响 ＤＮＡ 结构的完整性 ，将试剂盒说明 书方法进行改进 ，将破壁温度从 ７０ ℃上调至 ８５ ℃进行 ＤＮＡ 的提取 。提取的 ＤＮＡ 用 １．５％凝胶电 泳检测其完整性 ，并用 ＮＤ－１０００微量紫外分光光 度计测定核酸浓度 （ｎｇ／μ Ｌ ）及纯度 （ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ ）后 ，于 －２０ ℃保存备用 。 １．５．２ 总细菌及功能微生物的绝对定量 本课题组构建了总细菌及功能微生物的质 粒 ，对总细菌 、纤维降解菌 ［产琥珀酸丝状杆菌 （Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ）、黄色瘤胃球菌 （Ｒｕｍｉ⁃ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ）、白色瘤胃球菌 （Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃ⁃ｃｕｓ ａｌｂｕｓ ）、溶纤维丁酸弧菌 （Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌ⁃ｖｅｎｓ ）］、淀粉降解菌 ［反刍兽新月形单胞菌 （Ｓｅｌｅ⁃ｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ ）］、分解葡萄糖的细菌 ［普雷 沃氏菌属 （Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ）、栖瘤胃普雷沃氏菌 （Ｐｒｅｖｏ⁃ｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ ）］及免疫相关细菌 ［梭菌属 ⅪⅤ子 集 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ⅪⅤ）、乳杆菌属 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ⁃ｌｕｓ ）、拟杆菌属 （Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ）］进行绝对定量 。按 照焦金真等 ［２６］的方法 ，运用已验证的相应的微生 物的特异性引物 （表 ３），分别将含有特定微生物 组 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因插入物的质粒 ＤＮＡ 连续稀释 １０倍 ，构建标准曲线 。标准曲线的斜率在 －０．３１９ ７～－０．２９５ ９，并且相关系数 （Ｒ ２）均大于 ０．９９，符合实时荧光定量 ＰＣＲ （ｑＲＴ⁃ＰＣＲ ）的标准 曲线要求 。根据 ＭＩＱＥ 指南中微生物引物的扩增 效率 ＝１０－ｓｌｏｐｅ－１（ ｓｌｏｐｅ 为标准曲线的斜率 ）［２７］，可 以得到本试验中引物的扩增效率均处于 ９５％～１０５％，说明引物的扩增效率较好 。同时 ，每对引物 均设置相应的 ＮＴＣ 和 ＮＲＣ 。然后按照拷贝数公 式 ［拷贝数 ＝（标准曲线 Ｃｔ 值得到的拷贝数 ×每个 样品基因组 ＤＮＡ 的浓度 ×提取 ＤＮＡ 时最后溶解 ＤＮＡ 的 ｄｄＨ２Ｏ 的体积 ） ／（用于 ｑＲＴ⁃ＰＣＲ 的 ＤＮＡ 量 ×提取 ＤＮＡ 时所称量的食糜的重量 ）］计算出每 克食糜中总细菌及功能微生物的拷贝数 ，之后转 换为每克食糜中总细菌或功能微生物拷贝数的对 数值 ［ ｌｇ （拷贝数 ／ ｇ ）］进行统计分析 。 Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 引物序列 基因名称 引物序列 产物大小 扩增效率 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｎａｍｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ ／ ｂｐ （５′—３′） ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％ Ｔｏｌｌ样受体２ Ｆ：ＣＴＧＴＧＴＧＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡ ２２８ ９８．２ ＴＬＲ２ Ｒ：ＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡＡＣＣＡＧＡ Ｔｏｌｌ样受体４ Ｆ：ＧＧＴＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡ １３７ １０２．８ ＴＬＲ４ Ｒ：ＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＣ 干扰素－γ Ｆ：ＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＣＡＡＡＡ １００ １０５．１ ＩＦＮ⁃γ Ｒ：ＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＡＣＧＴＴ 白细胞介素－６ Ｆ：ＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＣＣ １９３ １０５．５ ＩＬ⁃６ Ｒ：ＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴ 白细胞介素－１７Ａ Ｆ：ＡＡＣＡＴＣＧＴＴＡＡＣＣＧＧＡＧＣＡＣ ６０ ９６．２ ＩＬ⁃１７Ａ Ｒ：ＧＧＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴ 白细胞介素－１７Ｆ Ｆ：ＣＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＣＣＡＴＣ １３１ １０３．５ ＩＬ⁃１７Ｆ Ｒ：ＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣ 白细胞介素－２６ ＩＬ⁃２６ Ｆ：ＣＣＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣ １００ １００．３ Ｒ：ＧＧＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣ 白细胞介素－１０ Ｆ：ＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＡＣＣ ５１ １０３．０ ＩＬ⁃１０ Ｒ：ＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＧＧ 白细胞介素－２２ Ｆ：ＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＧ ９９ １０４．４ ＩＬ⁃２２ Ｒ：ＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣ 白细胞介素－４ Ｆ：ＧＣＧＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＣＡ ７４ ９８．８ ＩＬ⁃４ Ｒ：ＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣ 闭合蛋白 Ｆ：ＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＧＣ １２４ １０４．２ Ｏｃｃｌｕｄｉｎ Ｒ：ＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＡ 封闭蛋白１ Ｆ：ＧＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴ １１２ １００．１ Ｃｌａｕｄｉｎ１ Ｒ：ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣ 封闭蛋白４ Ｆ：ＣＣＣＧＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣ １８５ ９８．５ Ｃｌａｕｄｉｎ４ Ｒ：ＧＴＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧ 紧密连接蛋白１ Ｆ：ＧＣＡＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡ １０７ ９５．８ ＴＪＰ１ Ｒ：ＴＧＣＴＴＣＣＧＧＴＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣ 类胰岛素生长因子受体１ Ｆ：ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＴＴＣ １０１ １００．２ ＩＧＦ⁃１Ｒ Ｒ：ＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡ 类胰岛素生长因子受体２ Ｆ：ＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡ １１１ ９５．５ ＩＧＦ⁃２Ｒ Ｒ：ＧＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧ ＧＡＰＤＨ 引物序列 扩增效率 产物大小 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ｎａｍｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ ／ ｂｐ （５′—３′） ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％ 类胰岛素样生长因子结合蛋白３ Ｆ：ＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＡＡ ８１ １０３．３ ＩＧＦＢＰ３ Ｒ：ＴＡＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣ 类胰岛素样生长因子结合蛋白５ Ｆ：ＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＣＣ ６３ １０５．１ ＩＧＦＢＰ５ Ｒ：ＴＣＣＡＣＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧ 胰岛素受体 Ｆ：ＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＧＡＣＴＡＴ １０６ ９７．５ ＩＮＳＲ Ｒ：ＡＧＧＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡ 生长激素受体 Ｆ：ＡＣＴＴＧＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＡ １０１ １０３．７ ＧＨＲ Ｒ：ＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧ 过氧化物酶体增殖因子激活受体 Ｆ：ＣＧＧＴＧＴＣＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＡ ５６ ９９．５ ＰＰＡＲＡ Ｒ：ＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＣＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡＡ 叉头转录因子１ Ｆ：ＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴ １０５ ９７．３ ＦＯＸＯ１ Ｒ：ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＡＡＡＴ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 Ｆ：ＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧ １４１ １００．２ ｍＴＯＲ Ｒ：ＧＴＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＴＣＧＧＡＴＧＡＡ 核糖体蛋白Ｓ６激酶Ｂ１ Ｆ：ＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣ １０１ １００．７ ＲＰＳ６ＫＢ１ Ｒ：ＴＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡ 葡萄糖转运蛋白１ Ｆ：ＣＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＴＣ ７５ １０３．１ ＧＬＵＴ１ Ｒ：ＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡ 葡萄糖转运蛋白４ Ｆ：ＧＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＧＴＣＴ ７９ ９９．９ ＧＬＵＴ４ Ｒ：ＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡ 钠－葡萄糖协同转运蛋白１ Ｆ：ＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣ １０９ １０５．４ ＳＧＬＴ１ Ｒ：ＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣ 钠－葡萄糖协同转运蛋白３ Ｆ：ＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧ １４２ １０２．０ ＳＧＬＴ３ Ｒ：ＴＧＡＴＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＡＣ 单羧酸转运蛋白１ Ｆ：ＣＧＡＧＣＣＧＣＧＴＡＴＡＡＣＧＡＴＡＣＴＴ １５７ １０５．１ ＭＣＴ１ Ｒ：ＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧ 丙酮酸羧化酶 Ｆ：ＡＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＴＧ ３５３ ９７．６ ＰＣ Ｒ：ＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧ 线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 Ｆ：ＣＣＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＣＴＡＡ １５１ １０５．１ ＰＥＰＣＫ⁃Ｍ Ｒ：ＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴ 基质金属蛋白酶１ Ｆ：ＧＧＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＣ １２０ ９８．５ ＭＭＰ１ Ｒ：ＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＡ 基质金属蛋白酶３ Ｆ：ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧ １３４ ９８．８ ＭＭＰ３ Ｒ：ＣＧＡＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＴＡ 基质金属蛋白酶９ Ｆ：ＧＡＧＧＧＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣ ２３６ １０３．９ ＭＭＰ９ Ｒ：ＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＴ 基质金属蛋白酶１３ Ｆ：ＡＣＣＣＴＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＣＴＴ １６２ １００．４ ＭＭＰ１３ Ｒ：ＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＴＧ β－肌动蛋白 Ｆ：ＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＧＴＡＡＴＧ １７７ １０２．６ β⁃ａｃｔｉｎ Ｒ：ＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧ ３－磷酸甘油醛脱氢酶 Ｆ：ＴＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴ ６０ ９６．２ Ｒ ：ＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＣＡＧ 项目 引物序列 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′—３′） 产物大小 Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ ／ ｂｐ 扩增效率 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ／％ Ｉｔｅｍｓ 总细菌 Ｆ：ＣＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ １４６ １０５．２ Ｇｅｎｅｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒ：ＣＣＡＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣ 梭菌属ⅪⅤ子集 Ｆ：ＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＣ ４３０ １００．８ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ⅪⅤ Ｒ：ＡＧＴＴＴＹＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡＣＧ 乳杆菌属 Ｆ：ＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧ １６６ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｒ：ＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＧ １００．１ 拟杆菌属 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｆ：ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣ Ｒ：ＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ １０８ ９８．９ 普雷沃氏菌属 Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ Ｆ：ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣ Ｒ：ＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧ １２１ ９５．５ 栖瘤胃普雷沃氏菌 Ｆ：ＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＴＴＡＡＴＧＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧ Ｒ：ＣＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＧＧＴＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧ ７４ １０２．１ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ 反刍兽新月形单胞菌 Ｆ：ＣＡＡＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧ １３８ １０４．４ Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ Ｒ：ＴＴＣＡＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧ 产琥珀酸丝状杆菌 Ｆ：ＧＴＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡ Ｒ：ＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＣ １２１ １０５．６ Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ 黄色瘤胃球菌 Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ Ｆ：ＣＧＡＡＣＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＴＡＧＧ Ｒ：ＣＧＧＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＡＣＣ １３２ ９９．９ 白色瘤胃球菌 １７６ １０４．０ Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ Ｆ：ＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＡＧＴＴＣＧ Ｒ：ＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＡ 溶纤维丁酸弧菌 Ｆ：ＴＡＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ Ｒ：ＣＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＧＣ Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ １３６ １０３．４ １．６ 数据统计与分析 试验数据采用 Ｒ 软件的 Ｓｔａｔｓ 基础包进行统 计分析 。鉴于目的基因表达量和微生物拷贝数的 数据不符合正态分布 ，因此 ，采用 Ｗｉｌｃｏｘ ’ ｓｒａｎｋ⁃ｓｕｍ 非参数检验法分析试验组与对照组在发酵参 数 、基因表达量及微生物拷贝数上的差异 。结果 以平均值和均值标准误表示 ，Ｐ ＜０．０５为差异显著 ，０．０５≤Ｐ ≤０．１０为差异趋于显著 ，Ｐ ＞０．１０表示差异 不显著 。 ２ 结果与分析 ２．１ 空肠发酵参数 由表 ４可知 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄 糖尽管在数值上降低了空肠食糜中乙酸和丁酸的 比例 ，但是差异均没有达到显著水平 （Ｐ ＞０．１０）。然而 ，添加过瘤胃葡萄糖有降低空肠食糜中总挥 发性脂肪酸含量的趋势 （Ｐ ＝０．０９４）。 表 ４ 过瘤胃葡萄糖对空肠发酵参数的影响 Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｊｅｊｕｎｕｍ 项目 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 试验组 均值标准误 Ｐ值 Ｉｔｅｍｓ Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ ＳＥＭ Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 总挥发性脂肪酸含量 ＴＶＦＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ／（ｍｍｏｌ／Ｌ） ５．３４ ２．９８ １．１２ ０．０９４ 乙酸比例 Ａｃｅｔａｔｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％ ７９．０５ ７７．３２ ２．１３ ０．５４８ 丙酸比例 Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％ １２．９０ １６．２６ １．２５ ０．３１０ 丁酸比例 Ｂｕｔｙｒａｔｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ／％ ８．０５ ６．４３ １．４０ ０．６９１ 乙丙比 Ａｃｅｔａｔｅ ／ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ ６．４８ ５．０４ ０．５８ ０．４２１ Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ｊｅｊｕｎａｌ ｍｕｃｏｓａ 项目 Ｉｔｅｍｓ 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 试验组 Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ 均值标准误 ＳＥＭ Ｐ值 Ｐ⁃ｖａｌｕｅ 葡萄糖转运蛋白１ ＧＬＵＴ１ １．００ ０．９４ ０．１０ ０．５５６ 葡萄糖转运蛋白４ ＧＬＵＴ４ １．００ ２．４９ ０．３４ ０．０６３ 钠－葡萄糖协同转运蛋白１ ＳＧＬＴ１ １．００ ０．９９ ０．１３ ０．７３０ 钠－葡萄糖协同转运蛋白３ ＳＧＬＴ３ １．００ １．２８ ０．１９ １．０００ 单羧酸转运蛋白１ ＭＣＴ１ １．００ ０．９２ ０．１７ ０．５５６ 丙酮酸羧化酶 ＰＣ １．００ ５．３５ ０．９５ ０．０１６ 线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶ＰＥＰＣＫ⁃Ｍ １．００ ０．４１ ０．２６ ０．４１３ ２．３ 空肠黏膜中免疫相关基因的表达量 由表 ６可知 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄 糖显著下调了空肠黏膜中细胞因子白细胞介 素 －２２（ ＩＬ ⁃２２）的表达量 （Ｐ ＝０．０１６），并且有下调 Ｔｏｌｌ 样受体 ４（ＴＬＲ ４）（Ｐ ＝０．０６３）、白细胞介素 － １７Ａ （ ＩＬ ⁃１７Ａ ）（Ｐ ＝０．０６３）和白细胞介素 －２６（ ＩＬ ⁃２６）（Ｐ ＝０．０６３）表达量的趋势 ，同时显著上调了 ｏｃｃｌｕｄｉｎ 的表达量 （Ｐ ＝０．０１６）；表中其他免疫相关 基因的表达量不受过瘤胃葡萄糖的显著影响 （Ｐ ＞０．１０）。 表 ６ 过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中免疫相关基因表达量的影响 Ｔａｂｌｅ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｉｎ ｊｅｊｕｎａｌ ｍｕｃｏｓａ 项目 Ｉｔｅｍｓ 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 试验组 Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ 均值标准误 ＳＥＭ Ｐ值 Ｐ⁃ｖａｌｕｅ Ｔｏｌｌ样受体２ ＴＬＲ２ １．００ １．３３ ０．０９ ０．１１１ Ｔｏｌｌ样受体４ ＴＬＲ４ １．００ ０．５８ ０．１０ ０．０６３ 干扰素－γＩＦＮ⁃γ １．００ １．０１ ０．２８ ０．７３０ 白细胞介素６ＩＬ⁃６ １．００ １．０７ ０．３３ ０．７３０ 白细胞介素－１７ＡＩＬ⁃１７Ａ １．００ ０．４２ ０．１７ ０．０６３ 白细胞介素１７ＦＩＬ⁃１７Ｆ １．００ １．１３ ０．２５ ０．９０５ 白细胞介素－２２ＩＬ⁃２２ １．００ ０．２０ ０．１５ ０．０１６ 白细胞介素－２６ＩＬ⁃２６ １．００ ０．４０ ０．２３ ０．０６３ 白细胞介素－４ＩＬ⁃４ １．００ １．２６ ０．２７ １．０００ 白细胞介素－１０ＩＬ⁃１０ １．００ １．１２ ０．２４ ０．９０５ 闭合蛋白 Ｏｃｃｌｕｄｉｎ １．００ ２．６０ ０．３１ ０．０１６ 封闭蛋白１ Ｃｌａｕｄｉｎ１ １．００ ０．７３ ０．１８ ０．４１３ 封闭蛋白４ Ｃｌａｕｄｉｎ４ １．００ ０．７０ ０．１０ ０．２８６ 紧密连接蛋白１ ＴＰＪ１ １．００ ０．９７ ０．１９ ０．５５６ ２．４ 空肠黏膜中细胞增殖分化相关基因的表达量 由表 ７可知 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄 糖显著性地上调了空肠黏膜中类胰岛素生长因子 结合蛋白 ５（ ＩＧＦＢＰ ５）的表达量 （Ｐ ＝０．０３２），同时 显著性地下调了基质金属蛋白酶 １（ＭＭＰ １）（Ｐ ＝０．０１６）和基质金属蛋白酶 ９（ＭＭＰ ９）（Ｐ ＝０．０３２） 的表达量 ，对表中其他细胞增殖分化相关基因的 表达量无显著影响 （Ｐ ＞０．１０）。 表 ７ 过瘤胃葡萄糖对空肠黏膜中细胞增殖分化相关基因表达量的影响 Ｔａｂｌｅ ７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｊｅｊｕｎａｌ ｍｕｃｏｓａ 项目 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 试验组 Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ 均值标准误 ＳＥＭ Ｐ值 Ｐ⁃ｖａｌｕｅ Ｉｔｅｍｓ 类胰岛素生长因子受体１ＩＧＦ⁃１Ｒ １．００ １．００ ０．１４ ０．７３０ 类胰岛素生长因子受体２ＩＧＦ⁃２Ｒ １．００ １．０９ ０．１５ ０．５５６ 类胰岛素生长因子结合蛋白３ＩＧＦＢＰ３ １．００ １．４９ ０．３１ ０．９０５ 类胰岛素生长因子结合蛋白５ＩＧＦＢＰ５ １．００ ２．１７ ０．２５ ０．０３２ 胰岛素受体ＩＮＳＲ １．００ １．５７ ０．２１ ０．２６８ 生长激素受体 ＧＨＲ １．００ １．０２ ０．１０ ０．９０５ 过氧化物酶体增殖因子激活受体 ＰＰＡＲＡ １．００ １．１５ ０．１１ ０．２８６ 叉头转录因子１ ＦＯＸＯ１ １．００ ０．８８ ０．１３ ０．７３０ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 ｍＴＯＲ １．００ １．３４ ０．１３ ０．４１３ 核糖体蛋白Ｓ６激酶 ＲＰＳ６ＫＢ１ １．２０ ０．２６ １．０００ 基质金属蛋白酶１ ＭＭＰ１ １．００ ０．３４ ０．１５ ０．０１６ 基质金属蛋白酶３ ＭＭＰ３ １．００ ０．９８ ０．１８ ０．７３０ 基质金属蛋白酶９ ＭＭＰ９ １．００ ０．３２ ０．１７ ０．０３２ 基质金属蛋白酶１３ ＭＭＰ１３ １．００ ０．７５ ０．２１ ０．４１３ 表 ８ 过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中总细菌 、拟杆菌属 、梭菌属 ⅪⅤ子集和乳杆菌属数量的影响 Ｔａｂｌｅ ８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ， Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ⅪⅤａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎ ｊｅｊｕｎａｌ ｃｈｙｍｅ ｌｇ （拷贝数 ／ ｇ ） 项目 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 试验组 Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ 均值标准误 ＳＥＭ Ｐ值 Ｐ⁃ｖａｌｕｅ Ｉｔｅｍｓ 总细菌 Ｇｅｎｅｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ７．６３ ７．５５ ０．１９ ０．６９１ 拟杆菌属 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ６．９２ ６．９６ ０．２１ １．０００ 梭菌属ⅪⅤ子集 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ⅪⅤ ５．９６ ６．７０ ０．２０ ０．０３６ 乳杆菌属 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ３．１９ ３．３０ ０．１５ １．０００ ２．６ 空肠食糜中碳水化合物降解菌的数量 由表 ９可知 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄 糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌 （降解纤维的 产琥珀酸丝状杆菌 、黄色瘤胃球菌 、白色瘤胃球 菌 、溶纤维丁酸弧菌与主要降解淀粉的反刍兽新 月形单胞菌以及分解葡萄糖的普雷沃氏菌属 、栖 瘤胃普雷沃氏菌 ）的数量没有产生显著影响 （Ｐ ＞０．１０）。 ３ 讨 论 围产期时奶牛大多处于能量负平衡状态 ［４－８］。本试验结果中发现 ，在围产期添加过瘤胃葡萄糖 可以降低奶牛空肠中总挥发性脂肪酸的含量 ，由 此推测添加的过瘤胃葡萄糖在小肠中被直接吸收 为奶牛供能 ，而减少了通过发酵供能带来的能量 损耗 ，有效地提高了能量利用率 ［２８－２９］。研究发现 围产期添加过瘤胃胆碱 ［３０－３１］和过瘤胃烟酸 ［３２］可 以显著地提高围产期奶牛的平均产奶量 。另外 ， 在围产期奶牛饲粮中添加酵母 β －葡聚糖也可以 提高产奶量及乳蛋白产量 ［３３］。经十二指肠灌输葡 萄糖可以提高奶牛的产奶量 、乳糖含量和乳蛋白 产量 ［１９］。与之吻合的是 ，本课题组前期试验结果 显示 ，添加过瘤胃葡萄糖可以提高围产期奶牛的 产奶量 （１８．９ ｋｇ／ｄ ｖｓ． １６．９ ｋｇ／ｄ ；Ｐ ＝０．０１）［３４］。如 前所述 ，添加过瘤胃葡萄糖避免了瘤胃对葡萄糖 的发酵 ，葡萄糖可到达小肠 ，直接作为能量供应者 替代了其他转换发酵等形式 ，提高了能量的利用 率 ，缓解了能量负平衡 ，某种意义上解释了围产期 奶牛产奶量提高的原因 。 表 ９ 过瘤胃葡萄糖对空肠食糜中碳水化合物降解菌数量的影响 Ｔａｂｌｅ ９ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ⁃ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ⁃ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｉｎ ｊｅｊｕｎａｌ ｃｈｙｍｅ ｌｇ （拷贝数 ／ ｇ ） 项目 对照组 Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ 均值标准误 ＳＥＭ Ｐ值 Ｐ⁃ｖａｌｕｅ Ｉｔｅｍｓ 试验组 Ｔｒｉａｌ ｇｒｏｕｐ 普雷沃氏菌属 Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ６．７６ ６．６９ ０．２１ １．０００ 栖瘤胃普雷沃氏菌 Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ ５．０５ ４．９１ ０．２２ ０．８４１ 反刍兽新月形单胞菌 Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ ５．４１ ５．３５ ０．１２ ０．７５３ 产琥珀酸丝状杆菌 Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ ４．３７ ４．８２ ０．２９ ０．６９１ 黄色瘤胃球菌 Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ４．６２ ４．５０ ０．１７ ０．６９１ 白色瘤胃球菌 Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ４．０８ ３．９８ ０．１５ ０．９１７ 溶纤维丁酸弧菌 Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ ６．６７ ６．４４ ０．１６ ０．６９１ 葡萄糖的吸收主要依赖于小肠上皮细胞膜上 的转运载体蛋白 ［３５］。转运蛋白载体主要分为 ２类 ［２０－２１］：钠 －葡萄糖协调转运蛋白 （ＳＧＬＴｓ ）和葡萄 糖转运蛋白 （ＧＬＵＴｓ ）。其中 ＧＬＵＴｓ 是一种可顺 其浓度梯度不消耗能量地被动运输葡萄糖 ，且受 饲粮因素的影响 ［１８］。卢艳娟等 ［３５］发现 ，将生长后 期滩羊 （３６～４０ ｋｇ ）的饲粮能量及蛋白质水平提高 ２０％，可以显著提高小肠中 ＧＬＵＴ ４的表达量 。与 之类似 ，本研究发现 ，添加过瘤胃葡萄糖提高了空 肠中 ＣＬＵＴ ４的表达量 ，增强了空肠对葡萄糖的吸 收和利用 。姜涛 ［３６］报道反刍动物所需葡萄糖的 ９０％是由糖异生提供的 。糖异生途径的关键酶是 ＰＣ 和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 （ＰＥＰＣＫ ），ＰＣ 的 表达量直接影响到肝脏糖异生的能力 ［３７］。本试验 结果显示 ，围产期添加过瘤胃葡萄糖可以提高空 肠黏膜中 ＰＣ 的表达量 ，这表明在奶牛能量负平衡 的情况下 ，添加过瘤胃葡萄糖可能会增加糖异生 作用 ，以弥补由于干物质摄入不足引起的能量缺 乏 ，从而缓解能量负平衡 。 Ｔｏｌｌ 样受体 （ＴＬＲｓ ）是一类在天然免疫中有重 要作用的跨膜信号传递的先天模式识别受体 ，通 过识别病原相关分子模式来迅速激活天然免疫系 统 ［３８］，进而诱导炎症因子的表达来参与炎症反 应 ［３９］。其中 ，ＴＬＲ ４是机体固有免疫和获得性免疫 的桥梁 。余盼等 ［４０］发现 ，ＴＬＲ ４在患有乳房炎的奶 牛的乳腺组织中的表达量较正常奶牛高 ，进而引 起其下游的细胞因子 ｍＲＮＡ 表达量显著升高 。围 产期由于存在多种应激 ，机体发生免疫抑制 ，多种 免疫细胞功能发生改变 ［２，６－７］，机体的免疫力下降 。柒启恩等 ［４１］的研究表明 ，围产期母猪饲粮中添加 壳寡糖能显著性地提高母体和子代的免疫力 ，提 高子代的存活率 。本研究结果显示 ，与对照组相 比 ，添加过瘤胃葡萄糖下调了空肠黏膜中 ＴＬＲ ４的 表达量和促炎性细胞因子 ＩＬ ⁃１７Ａ 、ＩＬ ⁃２２、ＩＬ ⁃２６的 表达量 ；与此同时 ，具有屏障功能的连接蛋白 ｏｃ⁃ｃｌｕｄｉｎ 的表达量有所上调 。这意味着添加过瘤胃 葡萄糖可以提高肠道的屏障功能 ，防止细菌等有 害物质进入 ［２３］。由此推断 ，围产期奶牛饲粮中添 加过瘤胃葡萄糖有可能通过介导炎症反应相关通 路基因的表达 ，改变肠道屏障功能 ，增强围产期奶 牛空肠的免疫应答能力 。 胰岛素样生长因子 （ ＩＧＦｓ ）在细胞分化和增殖 过程中发挥重要作用 ［４０］。胰岛素生长因子结合蛋 白 （ ＩＧＦＢＰｓ ）是参与协助 ＩＧＦｓ 的结合能力的主要 蛋白 ，其中 ＩＧＦＢＰ ５是 ＩＧＦＢＰｓ 家族中最保守的成 员 ，对 ＩＧＦｓ 信号具有重要的调节作用 。研究表 明 ，瘤胃上皮中 ＩＧＦＢＰ ５的表达量与乳头宽度呈显 著正相关 ，通过促进其形态学发育来促进乳头的 增长 ［４２］。景小平 ［４３］研究表明 ，冬季给藏绵阳添加 精料补充料 ，瘤胃乳头中 ＩＧＦＢＰ ５的表达量显著升 高 ，从而促进了瘤胃组织形态的发育 。鉴于 ＩＧ⁃ＦＢＰ ５表达量的升高预示着细胞分化及增殖能力 的提升 ，其在添加过瘤胃葡萄糖组的升高可以表 征肠道组织形态的改善及代谢功能的增强 。基质 金属蛋白酶 （ＭＭＰｓ ）是由多种基质细胞 、炎症细胞 等产生的高度保守的一类酶 ，其中 ，ＭＭＰ ９是参与 创面的修复和愈合过程中角质形成细胞从基底膜 脱离 、促进细胞沿创面基质爬行 、纤维蛋白 －纤维 连接蛋白基质的再塑形的重要调节蛋白 ［４４］，而 ＭＭＰ １在星状细胞中能够促进细胞外基质的降解 和纤维化的逆转 ［４５］。 Ｗａｔｈｅｓ 等 ［４６］研究表明 ，ＭＭＰｓ 在子宫内膜破裂中起着重要作用 。另外 ，李 云涛等 ［４７］报道 ，ＭＭＰ ９的表达量与创面愈合率呈 负相关 。本研究中 ，添加过瘤胃葡萄糖下调了空 肠黏膜中 ＭＭＰ １和 ＭＭＰ ９的表达量可以预示肠道 细胞损伤的修复 。 饲粮是影响胃肠道微生物群的重要因素之 一 ［４８］。例如 ，在幼羊饲粮中添加大黄有利于回肠 黏膜梭状芽胞杆菌 、乳酸菌和假单胞菌的定植 ［２３］。婴幼儿期肠道菌群定植发生在出生之前 ，大约 ３个月后就趋于稳定 ，其肠道微生物对机体成年期 新陈代谢以及后代的免疫系统均有影响 ［４９］。梭菌 是肠道一大类兼性厌氧微生物 ，与许多疾病息息 相关 。有益的梭菌属包括酪酸梭菌 、普拉梭菌等 ，它们维持肠道厌氧 ，保护肠黏膜屏障 ，防治腹泻的 发生 。有害的梭菌属包括艰难梭菌和产气荚膜梭 菌等 ，它们发酵能力强 ，产酸产气 ，损伤细胞膜 ，导 致细胞损伤 ，引起肠道炎症并导致腹泻 ［５０］。有研 究证实 ，梭菌属 ⅪⅤ子集属于拉氏螺旋体科 ，它的 丰富度与患炎症性肠炎的概率呈负相关 ［５１－５２］。本 研究结果显示 ，与对照组相比 ，添加过瘤胃葡萄糖 显著提高了空肠食糜中梭菌属 ⅪⅤ子集的数量 ，却未限制影响其他的功能微生物的数量 。由此推 测 ，围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖有可能 通过促进免疫相关有益菌梭菌属 ⅪⅤ子集的定 植 ，从而抑制肠道的炎症反应 ，降低患炎症性肠炎 的发生率 。 ４ 结 论 围产期奶牛饲粮中添加过瘤胃葡萄糖可以降 低空肠食糜中总挥发性脂肪酸的含量 ，上调与葡 萄糖转运 、糖异生 、细胞代谢相关基因的表达 ，促 进免疫有益菌梭菌属 ⅪⅤ子集的定植 ，在缓解炎 症反应的同时提高黏膜屏障功能 。过瘤胃葡萄糖 可以作为一种有效的饲料添加剂用于缓解奶牛围 产期的能量负平衡状态 。 参考文献 ： ［ １］ ＧＲＵＭＭＥＲ Ｒ Ｒ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｎｕｔｒｉ⁃ｅｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｎ ｆｅｅｄｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｄａｉｒｙ ｃｏｗ ［ Ｊ ］ ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ，１９９５，７３（９）：２８２０－２８３３． ［ ２］ ＤＲＡＣＫＬＥＹ Ｊ Ｋ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ： ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ？ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ，１９９９，８２（１１）：２２５９－２２７３． ［ ３］ 秦彤 ，王皓宇 ，郝海生 ，等 ．围产期奶牛代谢与营养调 控研究进展 ［ Ｊ ］ ．中国奶牛 ，２０１３（５）：２９－３３． ［ ４］ 宋元振 ，穆淑琴 ，李鹏 ，等 ．复方中草药添加剂对围生 期奶牛采食量及体质量影响的研究 ［ Ｊ ］ ．饲料研究 ，２０１３（３）：４４－４６． ［ ５］ ＧＲＵＭＭＥＲ Ｒ Ｒ ，ＭＡＳＨＥＫ Ｄ Ｇ ，ＨＡＹＩＲＬＩ Ａ．Ｄｒｙ ｍａｔｔｅｒ ｉｎｔａｋｅ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｅｒｉ⁃ｏｄ ［ Ｊ ］ ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ：Ｆｏｏｄ Ａｎ⁃ｉｍａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ，２００４，２０（３）：４４７－４７０． ［ ６］ 才文明 ，刘国文 ，张加力 ．围生期能量负平衡奶牛胰 岛素抵抗的研究进展 ［ Ｊ ］ ．黑龙江畜牧兽医 ，２０１７（３）：５２－５４． ［ ７］ 张凡建 ，乔立东 ，王明利 ，等 ．围产期奶牛代谢健康的 监控措施分析 ［ Ｊ ］ ．中国兽医杂志 ，２０１７，５３（６）：６６－６８． ［ ８］ 王树茂 ，李红宇 ，崔婷婷 ，等 ．围产期奶牛的饲养管理 要点 ［ 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