使用LC-MS/MS和生物分析仪对生产抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系统进行细胞培养分析

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检测样品: 生物药品药物研发
检测项目: 化合物发现
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发布时间: 2023-04-06
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岛津企业管理(中国)有限公司

钻石23年

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本文中,我们使用岛津细胞培养分析方法包通过LC-MS/MS方法监测mAb生产中的细胞培养工艺,该方法包能够在单个分析批中同时分析125种培养基组分。

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使用LC-MS/MS细胞培养分析方法包分析用于mAb生产的CHO细胞培养基中的营养成分和代谢物在5天内的变化趋势。在CD CHO培养基和CD/RF CHO培养基中分别共检出48种和52种组分,并对其相对浓度进行了定量。岛津SHIMAD之U ApplicationNews App l i c a t i onNe ws 细胞培养分析方法包/LCMS-8050 使用 LC-MS/MS 和生物分析仪对生产抗体的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞系统进行细胞培养分析 Tianhua Wang'; J unj i e Desmond L i n’; Si Yin L i m ', J o h n Goh'; Zhaoqi Zhan² 04-AD-0267 新加坡理工大学,新加坡?岛津新加坡 特点描述 ◆利用 L C -MS/MS 细胞培养分析方法包,可同时对细胞培养基中多达125种目标营养成分和代谢物进行分析。 ◆通过受检目标物的含量变化趋势图,可以直接查看代谢物浓度随细胞培养时间的变化。 ◆使用 LC-MS/MS 法得出的代谢物变化趋势与使用 CEDEX Bi o 分析仪观察到的趋势高度相关。 引言 中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞广泛应用于生物制药行业,是用 于生产包括单克隆抗体(mAb)在内的治疗性重组蛋白类药物的 主要工具。由于细胞生长和蛋白产物质量会受到关键营养成分消 耗或细胞代谢副产物蓄积的影响,因此通过监测 CHO细胞培养 过程中营养成分和代谢物的丰度,能够深入了解工艺性能。所以,有必要对细胞培养基进行全面分析,因为这些信息有助于开发均 衡的培养基处方和优化生物制药生产补料策略11.21。 使用生物反应器或独立生物分析仪上的常规传感器,在单个 分析批中最多只能监测10种代谢物。此外,可能需要使用昂贵 的试剂盒,并且其中一些试剂盒在开启后的保质期很短。这对实 验计划和资源分配造成额外压力。本文中,我们使用岛津细胞培 养分析方法包 归 通过LC-MS/MS 方法监测 mAb 生产中的细胞培 养工艺,该方法包能够在单个分析批中同时分析125种培养基组 分。 实验 CHO 细胞培养和生物分析仪监测 在 GibcoTM CD CHO培养基和一种混合培养基中维持CHO 细胞生产 mAb 的过程,该混合培养基由含有2g/L碳酸氢钠的 HyCloneTM PF CHO 多粉末系统和 CD CHO 以 1:1的比例混合而 成。每3天进行一次细胞传代,并通过 Vi -CELL XR 细胞活力分析仪 (Beckman Coulter) 监测细胞活力和密度。。一周后,扩大细胞培养物 规模,然后使其在摇瓶中生长5天,每天(第0天到第5天)进行 采样 使用 CEDEX Bio 分析仪 (Roc h e)测量细胞培养样品,该分析仪 通常用于使用专有检测试剂盒(分别为 Glucose Bio、 Lactate Bio 和 Gl u tamine V2 Bio) 检查包括葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺在内的重要细 胞培养代谢物水平。 表1细胞培养分析方法包在 LCMS -8050 上的分析条件 LC条件 (Nexera UHPLC) 色谱柱 Shim-PackTM GIST PFPP 色谱柱(2.1x150mm, 3um) 流速 0.3 mL/min 流动相 A: 0.1%甲酸水溶液 B:含0.1%甲酸的乙腈溶液 洗脱方式 梯度洗脱,20分钟 柱温 40°C 进样体积 1.0pL MS 条件 (LCMS-8050) 离子源 ESI, 正负离子同时扫描 接口温度 300°C DL 温度 250°C 加热模块温度 400°C 雾化气 3 L/min 加热气体流量 10 L/min 干燥气流量 10 L/min 扫描模式 MRM 通过 LC-MS/MS 法监测 CHO 细胞培养 使用由岛津开发的细胞培养分析方法包(第2版)监测培养基 组分和代谢物日。使用 Sh i m-Pack GIST PFPP 色谱柱 (2.1x 150mm,3 um) 对该即用型方法的分析条件(表1)进行了优化。每种化合 物包含两个 MRM 通道,作为定量离子和参比离子。向每份培养基 样品中加入内标(2-异丙基苹果酸),用于确保分析可靠性并获得 每种受检组分随细胞培养时间(第1天至第5天)的相对定量值(面 积比)。 LC-MS/MS 分析前的样品预处理 根据细胞培养分析方法包的说明手册 日 ,按照图1中所示的程 序对5个不同实验日采集的培养基样品等分试样进行预处理。在室 温下以3,000 rpm的转速对采集的培养基样品进行5分钟快速离心。将上清液转移至新的 1.5 mL离心管中并储存在-20°C下直至上机分 析。采集完所有样品后,按照步骤3至步骤8(图1)对样品进行 进一步预处理,以用于 LC-MS/MS 批分析。 图1用于LC -MS/MS 分析的细胞培养基样品采集和预处理程序 结果和讨论 使用 CCP 方法包进行组分检测 将两组重复细胞培养物在培养基 CD CHO 和培养基CD/PF CHO (1:1) 中进行5天维持培养。于 CD/PF CHO (1:1) 培养基 中生长的细胞在6天内的细胞密度曲线如图2所示 [2]。针对这 两组细胞培养物,在LCMS-8050 上使用 CCP方法首先分析第0天(开始细胞培养之前)和第5天采集的样品。这是因为第0天 培养基所含的营养成分(葡萄糖、吡哆醇和谷氨酸等)浓度最高。而在第5天培养基中,所产生的代谢物(脱氧胞苷、甲硫氨酸亚 砜和苹果酸等)浓度可能最高。针对 CCP 方法包中提供的125种目标分析物进行筛选,在 CD/PF CHO 培养基样品中共检出52种组分,而在 CD CHO样品中检出48种组分。后者缺少的四种 组分是牛磺酸、乌头酸、枸橼酸和2-氨基丁酸。第4天CD CHO 培养基的代表性色谱图如图3所示。请注意,首次在 LC-MS/MS 系统上分析样品时仔细进行色谱峰验证和保留时间调整。 图2:于细胞培养基 C D CHO 和 CD/PF CHO (1:1)中生长的 C H O细胞在5天内的活细胞密度曲线。 细胞培养期间受检分析物的趋势 对于这两组分析结果 (CD 和 CD/PF CHO [1:1]),均使用岛津 多组学分析包在 GARUDA 平台上导出并绘制成条形图[4]。观察到 受检分析物呈现三种不同趋势,即(a)分析物浓度随培养时间而 降低, (b)分析物浓度随培养时间而增加以及(c)分析物浓度 在整个期间波动。为方便起见,根据在 CD CHO中观察到的趋势(红 色趋势线)显示出结果,见图4a~4c。 例如,丙氨酸和乳酸随时间呈现增加趋势(图4a)。谷氨酰 胺和己糖呈降低趋势(图4b)。例如,脯氨酸和2-氨基丁酸保 持波动(图4c),而吡哆醇和2-氨基乙醇随时间而完全耗尽(图 4b)。总体而言,两种不同培养基中的代谢物趋势相似,但也存 在一些例外,如乳酸和腐胺。 LC-MS/MS 与生物分析仪测量值之间的相关性 基于 LC-MS/MS 的细胞培养分析方法是一种旨在同时测量细 胞培养过程中营养成分和代谢物变化趋势的新方法。对于葡萄糖 (己糖)、乳酸和谷氨酰胺水平,还使用专有测定试剂盒(分别 为 Glucose Bio、Lactate Bio 和 Glutami n e V2 Bio) 通过 CEDEX Bio 分析仪进行检查。虽然由于检测原理差异而直接比较测量值并无 实际用途,但非常重要的一点是针对受检的细胞培养样品,验证 通过这两种方法报告的趋势是否彼此几乎完全匹配。 min 图3:在第4天细胞培养基 (CD CHO)样品中检出的48种组分的 MRM 色谱图 图4a:在CD CHO培养基中,有 16种分析物随时间呈现增加趋势(红色趋势线)。黄色趋势线表示 CD/PF CHO 培养基中分析物的浓度变化。 图4b:在CD CHO培养基中,有 13种分析物随时间呈现降低趋势(红色趋势线)。黄色趋势线表示 CD/PF CHO 培养基中分析物的浓度变化。 图4c: 在 C D C H O培养基中,有12种分析物呈现波动趋势而有4种分析物未被检出(红色趋势线)。黄色趋势线表示 CD/PF CH O 培养基中分析物的浓度变化。 表2计算并报告了使用 LC -MS/MS 和 CEDEX-Bio 分析仪独立获 取的两组数据之间的相关系数。结果得出葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸 具有高度相关性,这为使用细胞培养分析方法包在 LC-MS/MS 上测 得的趋势提供了高可信度。 表2在 2个细胞培养过程(重复)中通过 LC -MS/MS 和 C ED EX-B i o 分析仪 获得的葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸测量值(第0天至第5天)的相关系数 细胞培养基 葡萄糖(己糖) 谷氨酰胺 乳酸 CD CHO_1 0.95 1.00 1.00 CD CHO_2 0.97 1.00 1.00 CD/PF CHO_1 0.99 1.00 1.00 CD/PF CHO_2 0.98 1.00 1.00 采用火山图进行生物统计分析 使用多组学分析包对第0天至第4天之间的浓度变化进行生 物统计分析。火山图[4,5]如图5所示, 其中 p<0.05 且涵盖2倍变化。对于 CD CHO培养基,鉴别出3种化合物(5-氧代脯氨酸、核黄素、谷氨酰胺)显著降低,而四种化合物(犬尿氨酸、甲硫 氨酸亚砜、丙氨酸和乳酸)显著增加。这些结果与图4中的趋势 线基本一致。对于图5(b)所示的 CD/PF CHO 培养基,显著降 低的化合物包括5-氧代脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸等。显著增加 的化合物包括丙氨酸、乳酸和甘氨酸。此外,两种培养基中的5-氧代脯氨酸和谷氨酰胺浓度均显著降低,这表明它们可能是细胞 生长所需的重要营养成分。两种培养基中的乳酸和丙氨酸浓度显 著增加,它们可能是分泌产物。 结论 使用 LC-MS/MS 细胞培养分析方法包分析用于 mAb 生产的 CHO细胞培养基中的营养成分和代谢物在5天内的变化趋势。在 CD CHO 培养基和 CD/RF CHO培养基中分别共检出48种和 52种组分,并对其相对浓度进行了定量。使用可向用户直接呈 现组分变化的多组学分析包,观察这些组分的浓度随时间呈现不 同变化趋势。对于葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸, LC -MS/MS 结果与 CEDEX Bio 分析仪的测量结果具有高度相关性。此外,针对在 CD CHO 和 CD/PF CHO培养基中检出的化合物,构建了第0天至第 4天的火山图。 岛津企业管理(中国)有限公司 岛津(香港)有限公司 http://www.shimadzu.com.cn 图5:在 (a) CD CHO 培养基和(b) C D /PF CHO培养基中检出的化合物的生 物统计分析火山图(包含95%置信区间与 2倍浓度变化)。 结果显示,5-氧 代脯氨酸和谷氨酰胺随时间显著降低;而在细胞 培养过程中,两种培养基中的乳酸和丙氨酸浓度显著增加。 参考文献 1. Zhiyuan Sun, Qinqin J i, Adam R Evans, Michael J Lewis, J i n gjie Mo, Pi n g H u;““High-throughput L C -MS quan t itat i on of cel l cu l ture metabolites”, Biologicals. 2019 Sep; 61: 44-51 2.Si Yin Lim , Singa p ore In s ti tu te of Technology, Bachelor’s Thesi s , “Metabolites Profi l ing St u dy f or Biophar m a Production”(2022) 3.Shimadzu , LC/MS/MS Met h od Pac k age for Cell C u l t ure Profiling Ver . 2 C146-E 408(2020) 4. Shimadzu, Multi-omics Analysis Package C146-E385B (2019)and h ttp://www.garuda-alliance.org/gadgetpack/shimadzu/ 5.Toyoda, H . Ku r oda, T. Suzuki, Shi m adzu Ap p lication News C209, Evaluation of Undifferen t iated State of Human iPS Cells Using C2MAPTM Cell Cu l t u re Media Analysis P l at f orm (2020) 岛津应用云 免责声明: *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售; *本资料中的所有信息仅供参考,不予任何保证。 如有变动,恕不另行通知。
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