小核酸药体外研究案例分析

小核酸药物即为寡核苷酸药物，一般是由不超过30个碱基/碱基对组成的核苷酸序列。小核酸药物是指能够与特定的mRNA结合，通过干预mRNA翻译效率，最终达到治疗效果的特定序列的小片段核苷酸。小核酸药物包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）药物、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）药物、微小RNA（microRNA，miRNA）药物、RNA适配体(Aptamer)药物等，其中ASO和siRNA是目前主流的小核酸药物研究方向。1    小核酸药现状与传统的小分子化学药和重组蛋白类药物相比，小核酸药物具有治疗效率高、特异性强、药物毒性小和应用领域广等诸多优点。目前，全球范围内共有15款小核酸药物获批上市（包含已退市产品），包括9款ASO药物，5款siRNA药物，1款核酸适配体，治疗领域主要涵盖杜氏肌营养不良症（DMD）、转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病和其他罕见性疾病。表1 全球已上市小核酸药物2    小核酸药体外研究案例分析到目前为止，业界尚无专门针对此类药物药理毒理研究的技术指南，ICH S6（R1）和美国FDA有关细胞和基因治疗的指导原则也仅提到小核酸药物可以参考。尽管小核酸药具备生物制品的属性，但仍按照新化学实体监管，开展相关非临床研究。表2 部分已上市小核酸药物研究内容汇总资料来源：王恒, 李华, 汪溪洁,等. 小核酸药物非临床特点和药理毒理评价策略[J]. 中国新药杂志, 2022, 31(12):9.3    IPHASE小核酸药物相关产品IPHASE凭借先进的设备、专业的技术人员和多年研发的经验，推出了不同种属动物的肝细胞、肝微粒体、肝S9、肝胞质液、肝溶酶体，ABC转运体囊泡和SLC转运体细胞，遗传毒性研究试剂盒（Ames、TK基因突变、染色体畸变、体外微核、彗星实验等），不同种属的血浆等产品，助力于小核酸药的体外研究。表3 IPHASE原代肝细胞表4 IPHASE肝亚细胞组分表5 IPHASE转运体表6 IPHASE遗传毒性产品表7 IPHASE空白生物基质产品IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为遗传毒性研究提供便捷产品。此外，IPHASE/汇智和源可提供特殊产品的定制服务，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线400-127-6686。发    文    章    得    奖    励凡使用本公司产品，在国内及国际刊物上发表论文（论文发表日起一年内），并注明产品属于北京汇智和源/IPHASE所有，即可申请奖励。根据发表刊物影响因子不同，给予不同金额奖品：非SCI论文及IF≤5分，500元礼品；5分＜IF≤8分 800元；8分＜IF≤10分 1000元；IF≥10分 2000元；注：礼品卡也可兑换同等金额产品购买抵用券；活动多多，礼品丰厚，快来参与吧！关    于    我    们汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。小核酸药体外研究案例分析 小核酸药物即为寡核苷酸药物，一般是由不超过30个碱基/碱基对组成的核苷酸序列。小核酸药物是指能够与特 定的 mRNA结合，通过干预mRNA翻译效率，最终达到治疗效果的特定序列的小片段核苷酸。小核酸药物包括反义 寡核苷酸 (antisense oligonucleotides， ASO) 药物、小干扰 RNA (small interfering RNA， siRNA) 药物、微小 RNA (microRNA， miRNA) 药物、RNA适配体(Aptamer)药物等，其中 ASO 和 siRNA 是目前主流的小核酸药物研 究方向。 1小核酸药现状 与传统的小分子化学药和重组蛋白类药物相比，小核酸药物具有治疗效率高、特异性强、药物毒性小和应用领域 广等诸多优点。目前，全球范围内共有15款小核酸药物获批上市(包含已退市产品)，包括9款 ASO 药物，5款 siRNA 药物，1款核酸适配体，治疗领域主要涵盖杜氏肌营养不良症 (DMD)、转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病和 其他罕见性疾病。 表1全球已上市小核酸药物 类别 药品 公司 上市时间 适应症 备注 ASO Fomivirsen Lonis，诺华 1998 巨细胞病毒性视网膜炎 已退市 Mipomersen Kastle 2013 纯合子型家族性高胆固醇症 已現市 Eteplirsen Sarepta 2016 杜氏肌营养不良症 / 诺西那生 Lonis， Biogen 2016 脊髓性肌萎缩症 / Inotersen Lonis 2018 转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病 / Volanesorsen Lonis 2019 家族性高乳糜微粒血症 / Golodirsen Sarepta 2019 杜氏肌营养不良症 / Viltolarsen Nippon Shinyaku 2020 杜氏肌营养不良症 / Casimersen Sarepta 2021 杜氏肌营养不良症 / SiRNA Patisiran Alnylam 2018 转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病 / Glvosiran Alnylam 2019 肝性卟啉症 / Lunsairan Alnylam 2020 高草酸尿症 / Inclisiran 诺华 2020 高胆固醇血症、动脉粥样硬化 / Vutrisiran Alnylam 2022 转甲状腺素蛋白家族性淀粉样多发性神经病 / Aptamer Pegaptanib Pfizer， Eyetech 2004 湿性年龄相关性黄斑病变 已現市 2小核酸药体外研究案例分析 到目前为止，业界尚无专门针对此类药物药理毒理研究的技术指南， ICH S6 (R1) 和美国 FDA有关细胞和基因 治疗的指导原则也仅提到小核酸药物可以参考。尽管小核酸药具备生物制品的属性，但仍按照新化学实体监管，开展 相关非临床研究。 表2部分已上市小核酸药物研究内容汇总 药品名称 给药方式 药效学研究 药动学研究 遗传毒性研究 Fomivirsen 玻璃体内注射 体外：原代人真皮成纤维细胞、 视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞分别转染人巨细胞病毒 (HCMV)，考察抗病毒活性及对 HCMV 临床分离株的抑制活 性。 体内：未开展。 吸收：采用猴玻璃体注射给药，考察体内吸收情况。 分布：采用兔和猴玻璃体注射给药，考察组织分布情况(放射性标记法) 以及血浆蛋白结合率实验。 代谢和排泄：伴随分布实验。 Ames 实验 染色体畸变实验 小鼠淋巴瘤实验小鼠体内微核试验 Pegaptanib 玻璃体内注射 体外：对人脐静脉内皮细胞 VEGF 与其受体结合的一致作用，对VEGF 诱导的内皮细胞增殖和钙代谢的抑制作用。 体内：采用豚鼠、大鼠和小鼠考察对血管生产的影响，采用人 A673 横纹肌肉瘤异种移植裸鼠模型考察抗肿瘤药效。 吸收：采用兔(眼玻璃体注射给药) 和猴(皮下、静脉和玻璃体注射)1考察吸收情况。 分布：采用小鼠静脉注射给药后分布情况及伴随吸收实验进行。 代谢：体外考察人、兔、猴和犬血浆中的代谢稳定性。排泄：伴随吸收和分布实验，考察兔经玻璃体注射给药 后的排泄情况。 Ames 实验 人淋巴细胞染色体畸变试验 仓鼠胚胎细胞转化实验 小 鼠体内微核实验 小鼠淋巴瘤细胞实验 Mipomersen 静脉注射 体外实验：采用人肝癌细胞株(HepG2和Hep3B)、人和食 蟹猴原代肝细胞，考察对载脂蛋白B的mRNA、蛋白和分泌蛋白的影响。体内实验：采用小鼠、仓鼠、兔 和猴，考察对载脂蛋白N水平的影响，采用高脂血症和动脉粥样硬化的啮齿动物模型及含有人类载脂蛋白B基因组转基因的小 鼠，考察载脂蛋白B是否降低以及是否可以使动脉粥样硬化(主动脉窦斑块体积)减少 吸收：采用小鼠、大鼠、猴、犬，考察体内吸收情况。 分布：血浆蛋白结合试验，体内实验伴随进行吸收实验。 代谢：体外检测微粒体和肝细胞中的药物浓度，体内采用猴进行代谢产物鉴定。 排泄：采用小鼠、大鼠和猴进行排泄实验 药物相互作用：细胞色素 P450(CYP)酶抑制和诱导实验，转运体实验。 Ames 实验 小鼠淋巴瘤细胞基因突变实验 小鼠体内微核实验 Eleplirsen 静脉注射 体外：采用肌细胞和肌移植物(来自于 DMD 患者)，考察对外显子51的跳跃情况。 体内：采用食蟹猴，静脉注射给药，考察在其股四头肌、心脏和横膈肌组织中肌营养不良蛋白基因第51外显子的跳跃情况以及 采用 DMD mdx小鼠模型考察药效。 吸收、分布、代谢和排泄：采用 DMDmdx小鼠，考察药物的吸收、分布、代谢及排泄情况(放射性标记，单次静脉注射)。 分布：采用超滤法评估小鼠、大鼠、猴、人肝微粒体中的血浆蛋白结合率。 代谢：进行小鼠、大鼠、猴、人肝微粒体代谢产物鉴定。 药物相互作用： CYP 酶诱导和抑制实验，转运体和底物考察。 Ames 实验 染色体畸变 小鼠微核遗传毒性试验 Defitelio 静脉注射 体外：采用人微血管内皮细胞系，分别考察在高密度培养细胞造成的压力、血清饥饿及氧化应激3种不同应激情况下对内皮细胞的保护作用，以及对基因表达和血 栓形成的影响。 体内：未进行 吸收、分布和排泄：采用大鼠，灌胃和静脉给药后，考察吸收、分布和排泄情况(放射性标记法)。 Ames 实验 中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变实验 大鼠体内微核试验 Nusinersen 脑脊液鞘内注射 体外：分别采用拼接实验、报告基因实验和 SMA 患者成纤维细胞，考察体外活性。 体内：采用小鼠SMA模型(转 染人SMN2基因)，考察注射该药后小鼠的 SMN 蛋白表达是否发生变化，采用重度平滑肌肌瘤小鼠模型 (Smn^7)，考察该药是否能使小鼠的运动能力改善及延长存活时间。 吸收和分布：采用成年猴和幼猴，考察脑脊液、血浆药物浓度和组织分布情况(单次和重复鞘内注射及静脉注射)。 分布：小鼠、猴和人血浆蛋白结合率实验。 代谢：伴随在猴14和53周重复给药毒性试验中，进行体内代谢产物鉴定。 排泄：未开展实验(预期经过尿液排泄)。 Ames 实验 体外染色体畸变实验小鼠体内微核实验 Inotersen 皮下注射 体外：分别采用人肝癌细胞 HepC2、表达人甲状腺腺素运载蛋白(TTR) 的雄性转基因小鼠新鲜分离的肝细胞以及新鲜分离 的雄性食蟹猴肝细胞，考察药物 能否降低 TTR mRNA 水平。体内：分别采用雄性 HTTR lle84Ser 转基因小鼠和食蟹猴，检测肝脏 hTTR mRNA水平和血浆 hTTR 蛋白水平。 吸收：分别采用小鼠和大鼠，皮下注射后考察体内吸收情况。 分布、代谢和排泄：大鼠皮下注射后，采用高效液相色谱-紫外分光光度 (HPLC-UV)、LC/MS、离子对高效液相色谱电喷雾/质谱法 (IP-HPLC-ES/MS)进行药物及其代谢物分析。 分布：用超滤法和 ELISA 法评估人和猴血浆蛋白结合率。 代谢：采用小鼠、猴进行体内代谢产物鉴定。 药物相互作用： CYP 酶抑制和诱导实验及转运体实验。 Ames 试验 中国仓鼠肺细胞染色体畸变实验 小鼠体内微核实验 Patisiran 静脉注射 体外：未开展。 体内：采用食蟹猴，静脉注射给药后，检查血清 TTR水平，以及伴随毒理实验考察血清中维生素 A和甲状腺素的水平。 吸收：采用大鼠和猴，考察体内。 分布：体外蛋白结合实验和采用大鼠和猴，考察组织分布情况。 代谢：体外代谢产物鉴定和大鼠体内代谢产物鉴定。 排泄：采用大鼠，考察药物的清除情况。 药物相互作用： CYP 酶抑制和诱导实验及转运体实验。 Ames 实验染色体畸变实验 小鼠体内微核实验 Golodirsen 静脉滴 注，每周1次 体外：磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(phosph orodiamidate morpholino oligomer，PMO)序列筛选实验，脱靶序列分析。 体内：分别采用 mdx转基因小鼠DMD 模型和正常小鼠考察体内药效。 吸收：未考察 分布：采用小鼠考察单次静脉注射给药后的分布情况；代谢和排泄(放射性标记法)，小鼠、大鼠、猴和人的血浆蛋白结合实验 代谢：伴随分布实验，考察小鼠、大鼠、猴和人肝微粒体的代谢情况。 排泄：伴随分布实验。 药物相互作用：考察对肝微粒体 CYP酶珀抑制作用，及对人肝细胞中 CYP酶的诱导作用，体外转运体实验。 Ames 试验 体外染色体畸变实验小鼠骨髓微核实验 Givosiran 皮下注射，每月1次 体外：转录水平筛选 siRNA，进行核苷酸多态性筛选，活性评价，脱靶分析。 体内：单次或重复给药对大鼠或 猴 ALAS1 mRNA的影响，采用 小鼠或大鼠急性间歇性卟啉症模型考察对 ALAS1 mRNA和尿液中的安吉乙酰丙酸(ALA)和胆色素原 (PBC) 的水平。 吸收：大鼠和猴单次皮下注射给药吸收实验。 分布、代谢和排泄：大鼠单次皮下给药代谢、排泄、物料平衡和组织分布实验(放射性标记法)，体外血浆蛋白结合试验。 药物相互作用：雄兔皮下注射给药精液转运实验。 Ames 实验 体外染色体畸变实验 大鼠骨髓微核实验 大鼠皮下注射围产期毒性实验 Waylivra 皮下注射 体外：采用人和猴的原代肝细胞、人肝细胞系 HepG2、APOC3转基因小鼠原代肝细胞考察对 apoC-III的抑制活性。 体内：采用体内药效模型(小鼠、大鼠、仓鼠和猴)考察对 apoC-III的抑制活性(小鼠和仓鼠由于与人 apoC-III序列存在差异，采用种属特性的 ASO 进行评价)。 吸收：分别采用小鼠、大鼠和猴，考察体内吸收情况。 分布：分别采用小鼠、大鼠和猴，考察体内分布情况(伴随吸收实验)，血浆(人、猴和小鼠)蛋白结合率实 验。 代谢：考察小鼠、大鼠和猴体内的代谢情况。排泄：大鼠排泄实验。 药物相互作用： CYP 酶抑制和诱导实验，转运体实验。 Ames 实验 哺乳动物细胞基因突变实验 小鼠染色体畸变实验 资料来源：王恒，李华，汪溪洁，等.小核酸药物非临床特点和药理毒理评价策略[].中国新药杂志，2022，31(12)：9. 3 IPHASE 小核酸药物相关产品 IPHASE 凭借先进的设备、专业的技术人员和多年研发的经验，推出了不同种属动物的肝细胞、肝微粒体、肝S9、肝胞质液、肝溶酶体 ， ABC 转运体囊泡和 SLC 转运体细胞，遗传毒性研究试剂盒 (Ames、TK基因突变、染色体畸变、体外微核、彗星实验等)，不同种属的血浆等产品，助力于小核酸药的体外研究。 表 3 IPHASE 原代肝细胞 Description State Unit Size IPHASE Human Hepatocytes Suspension， Plateable 4~6million IPHASE Monkey(Cynomolgus) Hepatocyte Suspension， Plateable 4~6million IPHASE Dog(Beagle) Hepatocytes Suspension， Plateable 4~6million IPHASE Rat(Sprague Dawley) Hepatocytes Suspension， Plateable 4~6million IPHASE Mouse(ICR/CD1) Hepatocytes Suspension， Plateable 4~6million IPHASE Mini-pig Hepatocytes Suspension， Plateable 4~6million 表 4 IPHASE 肝亚细胞组分 Description Strain Protein Concentration Unit Size IPHASE Human Liver Microsomes Homo sapiens 20mg/mL 0.5mL IPHASE Monkey Liver Microsomes Cynomolgus， Rhesus 20mg/mL 0.5mL IPHASE Dog Liver Microsomes Beagle 20mg/mL 0.5mL IPHASE Rat Liver Microsomes Sprague-Dawley、Wistar、Wistar Han 20mg/mL 0.5mL IPHASE Mouse Liver Microsomes ICR/CD-1、C57BL/6、KM、BALB/c 20mg/mL 0.5mL IPHASE Hamster Liver Microsomes / 20mg/mL 0.5mL IPHASE Feline Liver Microsomes / 20mg/mL 0.5mL IPHASE Minipig Liver Microsomes bama miniature pig 20mg/mL 0.5mL IPHASE Rabbit Liver Microsomes New Zealand， white big-ear 20mg/mL 0.5mL IPHASE Human Liver S9 Fraction Homo sapiens 20mg/mL 0.5mL IPHASE Monkey Liver S9 Fraction Cynomolgus， Rhesus 20mg/mL 0.5mL IPHASE Dog Liver S9 Fraction Beagle 20mg/mL 0.5mL IPHASE Rat Liver S9 Fraction Sprague-Dawley、Wistar、Wistar Han 20mg/mL 0.5mL IPHASE Mouse Liver S9 Fraction ICR/CD-1、C57BL/6、KM、BALB/c 20mg/mL 0.5mL IPHASE Minipig Liver S9 Fraction bama miniature pig 20mg/mL 0.5mL IPHASE Human Liver Cytosol Homo sapiens 10mg/mL 1mL IPHASE Monkey Liver Cytosol Cynomolgus， Rhesus 10mg/mL 1mL IPHASE Dog Liver Cytosol Beagle 10mg/mL 1mL IPHASE Rat Liver Cytosol Sprague-Dawley、Wistar、Wistar Han 10mg/mL 1mL IPHASE Mouse Liver Cytosol ICR/CD-1、C57BL/6、KM、BALB/c 10mg/mL 1mL IPHASE Minipig Liver Cytosol bama miniature pig 10mg/mL 1mL IPHASE Rat Liver Tritosome Sprague-Dawley 2-3 mg/mL 0.25mL 表 5 IPHASE 转运体 Description Concentration Unit Size IPHASE Human BCRP Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human BSEP Vesicle 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MDR1 Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MRP1 Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MRP2 Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MRP3 Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MRP4 Vesicles 5mg/mL 0.5 mL IPHASE Human MRP8 Vesicles 5mg/mL 0.5mL IPHASE Human OATP1B1 SLC Transporter Cells 8~10million cells IPHASE Human OAT1 SLC Transporter Cells 8~10million cells IPHASE Human OAT3 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human OCT2 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human OATP1B3 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human OATP2B1 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human OCT1 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human NTCP SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human MATE1 SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human MATE2K SLC Transporter Cells / 8~10million cells IPHASE Human OATP1A2 SLC Transporter Cells / 8~10million cells 表 6 IPHASE 遗传毒性产品 Description Unit Size IPHASE Ames Pre-Test Kit 150 dishes IPHASE Ames Test Kit，2 Bacterial 100 dishes IPHASE Ames Test Kit，4 Bacterial 200 dishes IPHASE Ames Test Kit，5 Bacterial 250 dishes IPHASE Ames Test Kit，4 Bacterial，Plate 200 dishes IPHASE Ames Test Kit，5 Bacterial，Plate 250 dishes IPHASE Ames Test Plate Kit 50 dishes IPHASE Ames Strain Identification Kit 10 test IPHASE Microtitre Fluctuation Ames Test Kit 16*96 well IPHASE In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Kit，CHL 5mL*20 test IPHASE In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Kit 5mL*20 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test，CHL 5mL*32 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test 5mL*32 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test，L5178Y 20mL*24 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 20mL*24 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test，V79 20mL*24 test IPHASE In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 20mL*24 test IPHASE Comet Assay Kit 50T 表 7 IPHASE 空白生物基质产品 Description Anticoagulant Unit Size IPHASEHuman Plasma， PPB EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Monkey(Cynomolgus) Plasma， PPB EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Dog(Beagle) Plasma， PPB EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Rat(Sprague-Dawley) Plasma， PPB EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Mouse(ICR/CD-1) Plasma， PPB EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASEHuman Plasma，Stability EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Monkey(Cynomolgus) Plasma，Stability EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Dog(Beagle) Plasma，Stability EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Rat(Sprague-Dawley) Plasma，Stability EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE Mouse(ICR/CD-1) Plasma，Stability EDTA-K2、Heparin sodium 5ml IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为遗传毒性研究提供便捷产品。此外， IPHASE/汇智和源可提 供特殊产品的定制服务，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线 400-127-6686。