藻蛋白含量的检测

藻蛋白含量测定取培养8 d 的藻样品5 000 r/min 离心10 min，蒸馏水洗涤2次，冷冻干燥，干燥后，用Gerhardt格哈特公司的VAPODEST 450全自动凯氏定氮仪测量，根据氮含量计算蛋白含量。广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第40卷 第6期2020年11月Vol.40 No.6Nov. 2020 广东海洋大学学报第 40卷36 黎钊坪，李雁群，李燕文，等.蛋白核小球藻富硒培养[].广东海洋大学学报，2020，40(6)：35-42. 蛋白核小球藻富硒培养 黎钊坪1.2，李雁群1.2.3，李燕文1，，岳 瑶1.2，郭桂筱1.2，胡雪琼1，2 (1.广东海洋大学食品科技学院/2.广东海洋大学食品科技学院海洋药物研究所//3.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江524088) 摘 要：【目的】对蛋白核小球藻进行富硒混和培养研究，为富硒小球藻保健品食品的开发提供基础。【方法】采用碳氮比营养优化及 pH 培养条件优化的方式提高生物量及胞内蛋白含量，并在此基础上进行硒富集培养，以荧光分光光度法检测细胞硒含量。【结果】当碳氮比(质量比)20：1时，生物量达到16.8 g/L， 细胞蛋白质质量分数为31.46%；当碳氮比15：1时，生物量为 16.1 g/L， 蛋白质含量为 43.69%；当碳氮比10：1时，生物量为14.7g/L， 蛋白含量为 45.21%。按单位培养液蛋白质产量计，以碳氮比15：1最佳。培养基起始 pH值为5.5时，藻细胞生物量可以达到18.9 g/L， 起始pH=5.5~6.5范围内，适合小球藻生长。在富硒试验中，当培养基亚硒酸钠质量浓度达 10 mg/L 及以下，对小球藻细胞生长无明显影响，高于 20 mg/L 抑制生长，高于 80 mg/L 会严重抑制生长；亚硒酸钠质量浓度为 10 mg/L 时， 藻细胞内的硒含量达到 54.9 pg/g，总富集硒量为927.9 pg/L培养液，硒的吸收效率为 20.3%。【结论】蛋白核小球藻能在混养培养下得到较高的生物量且具有较高的富硒能力。 关键词：微藻；蛋白核小球藻；富硒；混养 中图分类号： S968.4 文献标志码：A 文章编号：1673-9159(2020)06-0035-08 doi： 10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.008 Cultivation of Chlorella pyrenoidosa for Selenium Enrichment LI Zhao-ping 2， LI Yan-qun12.3， LI Yan-wen'， YUE Yao， GUO Gui-xiao'， HU Xue-qiong12 (1. College ofFood Science and Technology， Guangdong Ocean University //2. Research Institute forMarine Drugs and Nutrition， Guangdong Ocean University // 3. Guangdong Provincial Key Laboratoryof Aquatic Product Processing and Safety， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China) Abstract： 【 Objective】 To perform background study for the development of selenium-enriched food ofChlorella through mixotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa exposed in the selenium-enrichedmedia. 【Method】 Optimization of mc ： mn and pH were used to increase the biomass production andcell protein content， and the selenium in the media was enriched by the addition of sodium selenite. Theselenium content of C. pyrenoidosa was determined by fluorescence spectrophotometry.【Result】Biomass of 16.8 g/L and 31.46% of cell protein content was obtained when mc：mN=20： 1，16.1 g/L ofbiomass and 43.69% of cell protein content were obtained when mc ： mn = 15：1， and 14.7 g/L ofbiomass and 45.21% of cell protein content were obtained when mc ： mn=15： 1. Based on the proteinproductivity in cultivation broth， mc： mn =15 ：1 was considered the optimal nutrient condition. The 收稿日期：2020-07-09 基金项目：广东省国际合作项目(2017A050501038) 第一作者：黎钊坪(1996一)，男，硕士研究生，研究方向为微藻生物活性物质研究与开发。E-mail： 954952267@qq.com 通信作者：李雁群(1963一)，男，博士，教授，研究方向为发酵过程。E-mail： liyq2004@126.com yield could reach 18.9 g/L at 5.5 of the initial pH of medium， and the growth of Chlorella was normalpH 5.5 - 6.5. In selenium-enriching experiments， 10 mg/L and lower concentrations of selenite in themedia exhibited no significant effect on the growth of the Chlorella cells. However， 20 mg/L and higherconcentrations of sodium selenite inhibited the cell growth， and the sodium selenite >80 mg/L caused alethal effect on the algal growth. At the 10 mg/L in media， the selenium content in algal biomass reachedto 54.9 pg/g and the total absorbed selenium in the biomass was 927.9 ug/L， and the absorption rate ofselenium reached at 20.3%. 【Conclusion】 High selenium-enriching capacity of C. pyrenoidosa can beobtained under the mixotrophic cultivation. Key words： Microalgae； Chlorella pyrenoidosa； selenium enrichment； mixotrophic cultivation 我国人均硒摄入量仅为 26.33 ug/d，远低于WTO 推荐日摄入量 50~200 ug/d。硒缺乏会导致罹患克山病、心脑血管病、高血压等一系列疾病的风险上升[1-2]。因此，在日常膳食中，需要额外补充硒元素来保证每日最低摄入量。硒是超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)等多种酶的活性中心及辅助因子③，能有效清除自由基、提高免疫力及预防疾病4。但硒在自然界中主要以无机形态存在，毒性较强且消化吸收程度低，需要通过生物作为载体，将无机硒转化为有机硒耶。目前发现微藻能够吸收环境中的无机硒，通过富集和转化作用，变成有机硒16-7。因高溶解度，通常以亚硒酸钠为硒源。相比于陆生植物，水生生物对硒的吸收转化效率更高。 蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidesa) 富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、生长因子等营养成分旧。研究表明，小球藻作为营养补充剂，能有效提高人体维生素C摄入量，减少DNA损伤，具有良好的保健功胤。小球藻作为硒转化的载体，有其独特的优势。Dai等110研究发现，富硒小球藻中的硒氨基酸的生物利用度达到49%，是硒酵母的两倍以上。其次，硒主要与蛋白质结合，蛋白核小球藻蛋白质含量丰富，达45%以上[]，是硒蛋白的优质来源1121。 目前关于光自养条件下的小球藻富硒培养，在藻细胞耐受性[13]、相关酶活力、基因表达[14]等方面均有文献报导，光自养法培养存在生长周期长、易受污染、细胞密度低、离心成本高等缺点。在小球藻生产虾青素的研究方面，采用异养与自养相结合的混养方式能够在快速积累生物量的同时，增加虾青素的含量151。有文献报道，光照促进光合色素的合成，从而有利于增加藻细胞的硒耐受性6。通过混养进行富硒培养，可能实现在短时间内达到较高 的藻密度并在高细胞密度条件下增加富硒的量，但是，目前关于用混养的方式培养富硒蛋白核小球藻的研究鲜有报导。本研究拟通过混养条件优化提高藻细胞密度及蛋白质含量，在实现高密度培养的情况下进行富硒培养，以期为高附加值藻品的开发奠定基础。 材料与方法 1.1 材料与仪器 蛋白核小球藻(C. pyrenoidesa FACHB-5)购自中国科学院水生生物研究所淡水藻藻种库。采用Basal 培养基培养，组成为： KH2PO4 1 250 mg/L、MgSO4·7H2O 1 000 mg/L、EDTA 500 mg/L、HgBO3114.2 mg/L、CaCl2·2H20 111 mg/L、FeSO4·7H2049.8 mg/L、ZnSO4·7H2O 88.2 mg/L、MnCl·4H2014.2 mg/L、MoO2 7.1 mg/L、CuSO4·5H2O 15.7 mg/L、Co(NO3)2*6H20 4.9 mg/L。葡萄糖、硝酸钠、硒标准品，分析纯，购自湛江安培试剂公司。亚硒酸钠，分析纯，购自国药试剂集团。硝酸、高氯酸、硫酸，分析纯，购自湛江科诚试剂有限公司。2，3-二氨基萘(DAN)试剂，购自麦克林有限公司。 HZQ-F280 恒温摇床培养箱，江苏省金坛市万花实验仪器厂；ME204E电子分析天平(0.0001g)，北京赛多利斯天平有限公司； X-30R 高速冷冻离心机，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司； XW-80A 漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司； VAPODEST 450 全自动凯氏定氮仪，格哈特(中国)有限公司； FDU-1110 冷冻干燥机，上海旦鼎国际贸易有限公司； F-7000FL 荧光分光光度计， High-Tech Science Corporation。 1.2 实验方法 1.2.1 蛋白核小球藻混养培养优化 碳氮比优化： 在 250 mL 锥形瓶中加入100 mL Basal培养基，葡萄糖质量浓度为 50 g/L， pH 值为 6.5。根据碳源和氮源的比例添加硝酸钠，使最终碳氮比(质量比)为 10：1、15：1、20：1、40：1、60：1，培养基在121℃灭菌15 min， 冷却后在超净工作台中接种5 mL 处于生长对数期的藻液，，于温度(28.0±0.5)℃、照度4000 lx、150 r/min 的恒温摇床中培养8d。 pH值优化：在葡萄糖质量浓度为 50 g/L、优化的碳氮比条件下培养，调节培养基初始pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。 1.2.2 蛋白核小球藻混养富硒培养 在50 g/L 葡萄糖浓度、优化碳氮比、优化 pH的 Basal 培养基中加入质量浓度依次为0、2、5、8、10、20、40、60、80、100 mg/L 的亚硒酸钠。 1.2.3 生物量测量及比生长速率计算 使用干重法测量生物量：每24h取1mL藻液， 5 000 r/min离心5 min，蒸馏水洗涤2次，在鼓风干燥箱中50℃干燥，用分析天平称干重，小球藻生长td后的平均比生长速率pr按照公式(1)计算： 式中，ur是td的比生长速率，W，是小球藻第t天的生物量，W是初始生物量(接种生物量)。 1.2.4 藻蛋白含量测定取培养8d的藻样品5 000 r/min 离心 10 min， 蒸馏水洗涤2次，冷冻干燥，二干燥后，用全自动凯氏定氮仪测量，根据氮含量计算蛋白含量。 1.2.5 藻细胞硒含量测定 测定方法参考 GB5009.93-2017 的荧光分光光度法测量：藻细胞富硒培养8d后，5000 r/min 离心、蒸馏水洗涤2次、冷冻干燥。干干燥后，称取0.5 g藻粉加入10 mL混合酸(硝酸和高氯酸体积比9：1)和玻璃珠冷泡12 h， 220℃消化，过程中及时补加硝酸，消化至溶液透明清亮且有白烟产生后，加热到体积剩余约2mL，冷却，再加入5 mL 盐酸溶液(6mol/L)，再次220℃消化至清亮透明且有白烟产生，在加热至剩余2mL，冷却，加盐酸溶液(1.2mol/L)定容至50mL， 取10mL 样液加入 40 mL EDTA 混合溶液，调pH至1.5~2.0，于暗处加入6 mL DAN试剂，沸水浴 5 min， 冷却后加入6 mL 环己烷，摇4 min，用分液漏斗取环己烷层，荧光分光光度计测荧光光度值，用硒标准品作标准曲线，根据标准曲线计算硒含量。 1.2.6 单位培养液细胞富集硒总量 单位培养液细胞富集硒总量是指在小球藻培养液中富集到细胞内的硒的量，是指被细胞吸收进入胞内的硒的量，包括转化为有机硒的部分和暂时未转化的在胞内的硒。以式(2)计算： 式中：G为单位培养液细胞富集硒总量， ug/L；c表示每克藻细胞的硒元素含量， ug/g； m 表示培养液藻细胞生物量， g/L。 1.2.7 小球藻对硒的吸收率计算 硒吸收率指小球藻对培养基中硒进行富集进入细胞，富集硒占培养基中所添加硒量的百分比，以式(3)计算： 式中：W表示硒吸收率，%；G表示单位培养液藻细胞富集硒总量， ug/L； M} 表示亚硒酸钠的摩尔质量， 173 g/mol； Mz表示为硒的摩尔质量， 79 g/mol；p 表示培养基中添加的亚硒酸钠的质量浓度， ug/L。 1.3 数据处理 本研究实验数据为3组平行实验的平均值，数据采用 SPSS 22.0 进行显著性分析。用 OriginPro2018进行制图， P<0.05表示差异显著。 2 结果与讨论 2.1 碳氮比对蛋白核小球藻生长及蛋白质的影响 充足的氮源能够保证藻细胞的正常代谢，提高蛋白质含量。硒在藻细胞内主要与氨基酸结合，形成硒蛋白，而与多糖及脂肪酸的结合较少。要得到高产量的富硒产品，主要是要提高藻细胞的生物量和蛋白质含量。 蛋白核小球藻在不同碳氮比条件下生长曲线如图1所示。培养1~3d， 不同碳氮比条件下蛋白核小球藻生物量相差很小，第3天后，碳氮比为60：1组的细胞生长量比其他组明显更低，而碳氮比为40：1组中第5天后小球藻的生长才开始放缓。可见，氮源不足会导致细胞生长缓慢，即使此时培养基仍然有充足的碳源也无法维持细胞数量增长。碳氮比为20：1时，培养8d藻细胞生物量达到16.8 g/L，为碳氮比营养条件试验的各培养基中的最高值。 图2为小球藻比生长速率随碳氮比的变化。由图2可知，与碳氮比为60：1组相比，在碳氮比为 10：1、15∶1、20：1和40：1时，平均比生长速率出现显著性差异(P<0.05)，说明氮源的充足有利于蛋白核小球藻的生长，这符合细胞生长营养要求的一般规律，也与文献报道的研究结果一致17。 图1 碳氮比对蛋白核小球藻生长的影响 Fig.1 The effects of ratios of carbon to nitrogen in media onthe growth of Chlorella Pyrenoidosa 凡含相同字母表示差异不具统计学意义(P>0.05) The same letters between different groups mean that there is no significantdifference (P>0.05) 图2 碳氮比对蛋白核小球藻平均比生长速率的影响 Fig.2 Effects of the ratios of carbon to nitrogen in media onthe specific growth rate of Chlorella pyrenoidosa 碳氮比对小球藻蛋白质含量的影响如图3所示。从图3可知，氮源的添加能大幅度的提高蛋白核小球藻细胞内蛋白质的含量。在碳氮比为10：1的条件下，蛋白质的含量最高，达到 45.21%，与文献报导的小球藻蛋白质含量 40%~47%[18-19]的结果相似。在综合蛋白核小球藻的生物量及胞内蛋白质含量后，选择碳氮比条件为15：1，最高生物量能达到16.3 g/L，第8天生物量为 15.3 g/L， 细胞蛋白质含量为 43.69%，培养液蛋白质产量达到 6.70 g/L。 碳氮比 Ratios of carbon to nitrogen 凡含相同字母表示差异不具统计学意义(P>0.05)The same letters between different groups mean that there is no significantdifference (P>0.05) 图3 碳氮比对蛋白质含量的影响 Fig.3 Effects of ratios of carbon to nitrogen in media on theprotein contents of Chlorella pyrenoidosa 2.2 pH 值对蛋白核小球藻生物量和比生长速率的影响 微藻的 pH 耐受性差异性很大，不同藻种有不同的 pH 范围。在自养培养时， CO2是唯一C源，酸性环境可提高 CO2在水中以碳酸形式存在的比例，有利于细胞吸收，而过高的 pH 值则会降低 CO2的可用性，超过细胞的适应范围还会抑制藻细胞的生长20-211。在本研究中添加葡萄糖后，可以葡萄糖为C源，初始 pH不再是碳源供应的控制性因素，此时 pH 对蛋白核小球藻生长的影响体现在其他生理作用上。为了明确在混养条件下培养基 pH对小球藻生长的影响，观察了不同起始 pH条件的培养结果，结果如图4、5。图4为不同起始 pH 的藻生物量生长曲线，图5为不同pH条件下藻生物量的平均比生长速率。 图4 pH 对蛋白核小球藻生长的影响 Fig.4 Effect of pH on the biomass concentration of Chlorellapyrenoidosa 凡含相同字母表示差异不具统计学意义(P>0.05) The same letters between different groups mean that there is no significantdifference (P>0.05) 图5 pH对蛋白核小球藻比生长速率的影响 Fig.5 Effect of pH on the specific growth rate of Chlorellapyrenoidosa 图4、5可知，初始 pH 5.5最有利于藻细胞的生长，最高藻细胞浓度达到 18.9 g/L， 藻细胞的生长速率最高，比生长速率达 0.42。当 pH 值大于6.5时，藻细胞的生长受到显著抑制(P<0.05)。 培养基起始 pH 不仅影响微藻开始阶段的生长，还影响整个生长过程，在光自养培养条件下，如果仅以硝酸钠作为N源，当硝酸钠中的 NO3 消耗后，剩余的 Na*使培养基的 pH升高。一般小球藻不适合在碱性条件生长22]，因此，在光自养条件下初始 pH 偏碱性一般不利于小球藻的生长。本研究起始 pH在 8.5的条件下，虽然生长量和生长速率不如在偏酸性条件好，但是也能支撑较高的生长量，生物量达到14.6 g/L， 比生长速率为0.38，这可能是因为在混养条件下，由于葡萄糖作为碳源，细胞代谢产酸，中和了硝酸钠消耗产的碱。根据试验结果，本研究选择起始 pH 5.5进行后续的富硒混养培养。 2.3 蛋白核小球藻硒耐受性 亚硒酸钠浓度从0到100mg/L的不同培养基中蛋白核小球藻的生物量生长如图6所示，图7为在相同条件下相应的藻生物量比生长速率。 从图6、7可知，与不加硒的培养基对比，低浓度的亚硒酸钠(≤10mg/L)对蛋白核小球藻的生长无显著影响(P>0.05)。培养基中亚硒酸钠质量浓度为 20~60 mg/L 时，会抑制小球藻的生长，且浓度越高，对小球藻的抑制作用越明显。当亚硒酸钠的浓度超过 80 mg/L时，完全限制藻细胞的生长，藻液在第5天出现红硒现象，小球藻细胞死亡。Zhao等3研究表明，在培养基中硒酸钠浓度<10 mg/L 9 图6 蛋白核小球藻在不同含硒培养基中的生长曲线 Fig.6 The growth of Chlorella. pyrenoidosa in the mediacontaining different contents of selenium 与空白组相比较，*表示差异具有统计学意义，P<0.05。Compared with control group， * means the significant difference， P<0.05. 图7 硒浓度对小球藻比生长速率的影响 Fig.7 Effect of different selenium concentrations on thespecific growth rate of Chlorella pyrenoidosa 时，与不添加硒酸钠对照相比，蛋白核小球藻的生长无显著性差异，在亚硒酸钠浓度20~40 mg/L中培养，蛋白核小球藻的生长受到抑制，当亚硒酸钠浓度>60 mg/L 时，藻细胞死亡。与 Zhao 等研究结果相比，本研究显示出更高的耐受性。这可能是由于在本研究的混养模式下细胞生物量较高，培养液中的硒被吸收进入细胞的速度较快，培养液中的硒浓度较快降低到安全水平，减轻了亚硒酸钠对藻细胞生长的影响。在藻细胞内，硒主要与氨基酸结合。硒氨基酸主要有硒代甲硫氨酸(SeMet) 及硒代半胱氨酸(SeCys)， SeMet 和 SeCys 是一些硒蛋白的合成前体物质，低浓度时，硒能够增加GSH-PX、SOD、CAT的活性23]，使光合色素含量增加[14]，从而使藻细胞的抗氧化能力增强。但是过量的 SeCys 及 SeMet 会导致蛋白质的合成错误，使 活性氧簇(ROS)的含量增加，对藻类产生毒性，因此硒对小球藻的生长具有双重作用，低浓度的硒能够促进小球藻的生长，而高浓度的硒则会抑制藻细胞的生长甚至导致死亡。 2.4 培养基亚硒酸钠浓度对小球藻细胞硒含量的影响 在不同含硒浓度的培养基中培养的小球藻细胞硒含量结果如图8所示。在亚硒酸钠质量浓度低于 5 mg/L 时，藻细胞富硒效果不明显。提高亚硒酸钠的浓度，细胞的硒含量逐渐增加。亚硒酸钠浓度质量为 10 mg/L 时藻细胞的硒含量达到 54.9 ug/g，亚硒酸钠质量浓度为 60 mg/L时藻细胞的硒含量达到 299.3 ug/g，硒富集效果显著。此结果虽然比Zhong等23J人在自养条件下获得的 435 ug/g 细胞硒含量低，但一般实验室光自养培养的细胞生物量浓度低于2 g/L(干物质)[24-25]，大规模的开放池培养生物量浓度更低，一般不到1 g/L，而本研究在亚硒酸钠质量浓度 10~40 mg/L 的培养基中生物量在11.6~16.9 g/L 之间。以此推算，单位培养液的胞内硒产量不超过 870 ug/L。本研究采用混养培养策略，以亚硒酸钠质量浓度为 10 mg/L 的培养条件计，生物量浓度为 16.9 g/L，胞内硒产量达到 927.9 ug/L，因此本研究获得了较高的硒富集量。 图8 培养基亚硒酸钠浓度对蛋白核小球细胞硒含量影响 Fig. 8 The effects of sodium selenite concentration in mediaon the selenium content in Chlorella pyrenoidosa 图9为不同浓度亚硒酸钠培养下单位体积培养液藻细胞富集的总硒含量变化。在亚硒酸钠质量浓度为8~40 mg/L时，随着浓度的增加，单位培养液细胞富集硒总量增加，在亚硒酸浓度为 40 mg/L时，单位培养液中细胞富集硒总量达到最高，达2 466.2 ug/L。超过此浓度后，单位体积细胞总硒含量下降，这是由于藻细胞生物量浓度降低，虽然细胞硒含量高，但单位体积细胞总硒含量下降。 图9 在不同的培养基硒酸钠浓度条件下培养液细胞富集硒总量 Fig. 9(Contents of total absorbed selenium in the cultivationmedia containing different concentrations of sodium selenite 图10为在不同亚硒酸钠浓度的条件下亚硒酸钠的吸收率变化。在亚硒酸钠浓度为 10 mg/L时，硒吸收效率最高，达到20.3%。这是添加的硒被富集的效率，与单个细胞达到的硒含量有关也与培养液细胞生物量生长水平有关。从目前的文献报道看，就蛋白核小球藻来说，由于光自养培养生物量低，藻的硒吸收率不足5%[13，22-26]，培养后产生大量的含硒废水。混养培养相对比光自养培养，生物量浓度更高，从而总的细胞硒吸收率更高。硒吸收率提高可以减少生产中亚硝酸盐的浪费以及减轻含硒废水处理负担。当然，即使混养培养，大部分硒还留在培养基中没有被藻细胞吸收，因此在如何进一步提高吸收率和培养基的循环利用127等方面需要进一步开展研究。另外，与光自养相比，混养培养中需要加入有机碳源，本实验采用葡萄糖作为碳源，成本较高，需要进一步研究如糖蜜128作为碳源的富硒培养，以降低生产成本。 图10 蛋白核小球藻硒吸收率 Fig. 10 Selenium absorption rate in the cultivation ofChlorella pyrenoidosa 3 结论 蛋白核小球藻在混养时，需要添加适量的碳氮源及调整初始 pH， 碳氮比在10：1~15：1、pH值在5.5~6.0的范围内小球藻的生物量及蛋白质含量较高，碳氮比为 15：1的营养条件可以获得更好的经济性。培养基中硒质量浓度≤10 mg/L 时不影响蛋白核小球藻的生长，超过则会对小球藻生长产生逐渐增加的抑制作用，生产中亚硒酸钠添加浓度可以定为 10 mg/L。添加硒酸钠的浓度达到 10 mg/L时，培养液藻对硒吸收率达到最高20.3%，可以获得927.9 ug/L 的细胞内硒。 参考文献 [1] 聂婷婷，李晖.硒与心血管疾病相关性的研究进展[.中国食物与营养，2019，25(9)：9-13. 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