高效液相色谱法测定饲料中生物胺

动物从动物源性饲料中摄取的生物胺若超量易在动物体内残留，进而引发人体超量摄入生物胺导致的不良反应。为避免此类状况，动物源性饲料中生物胺含量需严格控制。参考GB/T 23884-2021福立仪器对动物源性食品鱼粉，对9种生物胺进行相关检测，从饮食源头控制生物胺。部分数据结果如下，下载可查看完成结果。9种生物胺标准溶液衍生化典型谱图（50.0 µg/mL）某鱼粉样品样品中生物胺测定谱图印FUL浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 动物源性饲料中生物胺的测定高效液相色谱法 一、检测方法： 依据国家标准：动物源性饲料中生物胺的测定高效液相色谱法 (GB/T 23884-2021))。 二、方法提要 试样中的生物胺经高氯酸溶液提取、丹磺酰氯衍生，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。经高效液相色谱分离，紫外检测器检测。根据保留时间定性，外标法定量。 三、试剂和材料 3.1水：娃哈哈纯净水。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3丙酮：分析纯。 3.4氨水：优级纯。 3.5乙酸铵：分析纯。 3.6氢氧化钠：分析纯。 3.7浓盐酸：分析纯，37% 3.8高氯酸： 优级纯，川770%-72% 3.9碳酸氢钠：分析纯。 3.10丹磺酰氯：阿拉丁试剂， CAS 号：605-65-2，≥98% 3.11丹磺酰氯衍生溶液(10mg/mL)：称取1g丹磺酰氯，用丙酮溶解，定容至100 mL。临用现配。 3. 乙酸铵溶液(5 mmol/L)：称取0.38g乙酸铵，加水溶解定容至1L。 3.13高氯酸提取液液 (0.4 mmol/L)：准确量取高氯酸3.23mL， 用水定容至100 mL。 3.14氢氧化钠(2mmol/L)：准确称取8g氢氧化钠，用水定容至100mL。 3.15饱和碳酸氢钠溶液：称取1g碳酸氢钠至 10mL容量瓶内，加水至刻度，超声溶解，完全溶解后再加入0.2g碳酸氢钠至容量瓶内，超声溶解 25 min， 过滤后备用。或买市售饱和碳酸氢钠溶液豆(氨道) 3.16盐酸溶液(0.1mol/L)：准确量取 0.83 mL浓盐酸，用水定容至100mL。 3.17九种生物胺标准溶液：直接购买市售有证的九种生物胺标准溶液，溶剂为 0.1 mol/L盐酸 水溶液，，浓度为 250 mg/L。参考标准溶液证书进行保存。 3.18组胺：CAS号：51-45-6，98.5% 3.19 滤膜： 0.45 um 聚四氟乙烯滤膜。 四、仪器和装置 4.1高效液相色谱仪：福立 LC5090 高效液相色谱仪，配备 LC5090 在线脱气机、LC5090四元低压输液泵、LC5090 自动进样器、LC5090 柱温箱、LC5090双波长-紫外检测器。 4.2色谱柱： Sunniest C18 色谱柱二，，4.60 mm *250 mm， 粒径为5.0 um。 4.3一次性注射器。 4.4针头过滤器：0.45 um 有机滤膜。 4.5抽滤瓶。 4.6真空泵。 4.7微孔滤膜 0.45 um。 4.8超声清洗仪。 4.9恒温摇床。 4.10旋涡混合器。 4.11离心机：转速不低于5000 r/min。 4.12分析天平。 4.13移液管(2mL、10mL)或微量注射器(1mL)。 4.14一般实验室常用仪器和设备。 五、实验 5.1标准系列配置 5.1.1 九种生物胺系列标准溶液：取九种生物胺标准溶液适量于 10mL棕色容量瓶中，用水稀释，配制浓度分别为 0.25 ug/mL、0.5 ug/mL、5.0 ug/mL、10.0 ug/mL、25.0 ug/mL、50.0 ug/mL和 100 ug/mL 的标准系列溶液。 5.1.2组胺标准溶液的配置：取组胺 0.0280g组胺于 10 mL 棕色容量瓶中，用 0.1 mol/L 盐酸溶液定容至刻度，配制成浓度为 2758 ug/mL 的组胺溶液(浓度已按纯度98.5%折算)C 5.2样品制备 5.2.1提取 5.2.1.1样品：称取鱼粉样品1.0135 g， 置于 50mL 棕色离心管中，准确加入10mL(移液管移取)高氯酸提取液，漩涡混匀30s，置于摇床上，室温下 200 r/min 振荡 10 min， 于 5000 r/min 离心10 min， 上清液倒入20 mL容量瓶中，残渣再用10mL(移液管移取)高氯酸提取液提取，重复上述操作，合并上清液于20 mL容量瓶中，备用。 5.2.1.2加标样品：称取样品 1.0059 g， 置于50mL棕色离心管中，准确加入 100 pL 2758 ug/mL的组胺溶液，用准确加入9.9mL(移液管移取)高氯酸提取液，漩涡混匀30s， 置于摇床上，室温下200 r/min 振荡 10 min， 于5000 r/min 离心 10 min， 上清液倒入 20 mL 容量瓶中，残渣再用10 mL(移液管移取)高氯酸提取液提取，重复上述操作，合并上清液于20 mL容量瓶中，备用。 5.2.2衍生化 5.2.2.1准确移取各定容后的上清液1mL， 放入10mL 棕色容量瓶中，依次加入200 uL 氢氧化钠溶液、300 uL饱和碳酸氢钠溶液和2mL丹磺酰氯衍生溶液，旋涡混匀，置于恒温摇床上，45℃避光反应 45 min。加入100 uL氨水终止反应，混匀，静置15 min， 用初始流动相定容至刻度，超声混匀，用0.45 um 有机微孔滤膜过滤备用。 5.2.2.2准确量取九种生物胺系列标准溶液各1mL 与试样溶液同时进行衍生。 5.3分析结果 5.3.1九种生物胺标准溶液典型谱图及结果 (50.0 ug/mL) 序号 组分名 保留时间/min 峰高/uAU 峰面积/uAU*s 理论塔板数 分离度 拖尾因子 1 色胺 14.09 19.9192 189.2037 51336 0 1.016 地址：浙江温岭城东街道百丈南路95号 邮编： 317500 浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 2 苯乙胺 16.384 33.9472 309.3151 76535 9.473 1.023 3 腐胺 17.44 91.9597 835.2556 92943 4.548 1.145 4 尸胺 18.529 77.7101 641.4104 117882 4.909 1.038 5 组胺 19.16 72.5223 620.3217 118843 2.888 1.016 6 章鱼胺盐酸盐 20.027 36.5855 290.5965 151964 4.062 1.053 7 酪胺 23.072 76.7136 535.3907 257799 15.77 1.055 8 亚精胺 23.752 107.5967 735.4655 284394 3.791 1.061 9 精胺 27.212 84.475 665.2009 276148 18.007 1.064 5.3.2九种生物胺标准溶液六针重复性谱图及结果(50.0 ug/mL) [min1 序号 组分名 平均保留时 保留时间 平均峰面积 峰面积 平均峰高 峰高 RSD/% 1 色胺 14.071 0.087 189.2954 0.101 19.9044 0.178 2 苯乙胺 16.368 0.059 309.3671 0.116 33.9191 0.178 3 腐胺 17.426 0.049 835.9557 0.095 91.7555 0.18 4 尸胺 18.517 0.036 641.307 0.113 77.6576 0.212 5 组胺 19.149 0.03 621.5445 0.148 72.6975 0.184 6 章鱼胺盐酸盐 20.017 0.026 290.6237 0.108 36.5194 0.206 7 酪胺 23.068 0.011 535.6738 0.09 76.8668 0.223 8 亚精胺 23.748 0.012 735.975 0.068 107.6735 0.239 邮编： 317500 9 精胺 27.212 0.03 665.7685 0.105 84.589 0.225 5.3.3标准曲线 标准曲线的绘制：分别进样浓度为0.25 ug/mL、0.5 ug/mL、5.0 ug/mL、10.0 ug/mL、25.0ug/mL、50.0 ug/mL 和 100 ug/mL 的标准系列溶液各10pL， 进行 HPLC 分析。然后以峰面积为纵坐标，以目标物的含量为横坐标，绘制标准曲线。 组分[色胺]：曲线方程： Wi= 3.52731E-006 + 2.57214E-009*Ai 校正因子： f0=3.52731E-006， f1=2.57214E-009相关系数：r^2=0.99981 组分[苯乙胺]： 曲线方程： Wi= -6.3584E-008+1.60659E-009*Ai 校正因子： f0=-6.3584E-008， f1=1.60659E-009 相关系数：r^2=0.99999 组分[腐胺]：曲线方程： Wi = -6.228E-006 +6.07647E-010*Ai 校正因子： f0=-6.228E-006， f1=6.07647E-010相关系数： r^2=0.99984 组分[尸胺]：曲线方程： Wi= 5.14095E-007 + 7.80833E-010*Ai 校正因子： f0=5.14095E-007，f1=7.80833E-010 相关系数： r^2=0.99998 组分[组胺]：曲线方程： Wi= 1.12743E-006 + 7.91247E-010*Ai 校正因子： f0=1.12743E-006， f1=7.91247E-010相关系数： r^2=0.99998 组分[章鱼胺盐酸盐]：曲线方程： Wi = 5.23751E-006 + 1.68148E-009*Ai 校正因子： f0=5.23751E-006， f1=1.68148E-009 相关系数： r^2= 0.99973 组分[酪胺]：曲线方程： Wi =9.20437E-007 + 9.23443E-010*Ai 校正因子： f0=9.20437E-007， f1=9.23443E-010相关系数：r^2=0.99998 组分[亚精胺]： 曲线方程： Wi=5.10652E-008+6.73694E-010*Ai 校正因子： f0=5.10652E-008. f1=6.73694E-010 相关系数：r^2=0.99996 组分[精胺]：曲线方程： Wi= 2.59605E-006 +7.47024E-010*Ai 校正因子： f0=2.59605E-006， f1=7.47024E-010相关系数：r^2=0.99995 5.3.4检出限 峰序 平行测定 1/ 2/ 3/ 4/ 5/ 6/ 7/ 检出限/mg/kg 标准要求检出限/ 1 色胺 0.6107 0.593 0.5896 0.6095 0.5977 0.6102 0.6029 0.5463 5 2 苯乙胺 0.3601 0.3715 0.3764 0.3677 0.3697 0.3734 0.3711 0.3240 5 3 腐胺 0.0456 0.0514 0.054 0.0462 0.0525 0.0524 0.0401 0.3175 5 4 尸胺 0.3574 0.3669 0.3693 0.3703 0.3721 0.375 0.3725 0.3616 5 5 组胺 0.3048 0.2999 0.298 0.2996 0.2966 0.2978 0.2982 0.1685 5 6 章鱼胺盐酸盐 0.9128 0.9059 0.9156 0.8981 0.8998 0.9023 0.9043 0.4093 5 7 酪胺 0.338 0.338 0.3387 0.3378 0.3379 0.3363 0.3372 0.0476 5 8 亚精胺 0.2161 0.224 0.224 0.2225 0.2241 0.2277 0.2321 0.3070 5 9 精胺 0.4888 0.4866 0.4871 0.4898 0.4886 0.4894 0.4873 0.0774 5 检出限按称样量 1g， 提取体积 20 mL计 5.3.5样品典型谱图及结果 盐盐婴 序号 组分名 保留时间/min 峰面积/uAU*S 峰高/uAU 含量/mg/kg 1 腐胺 17.494 28.6493 2.6632 22.00 2 尸胺 18.583 54.8929 7.0347 85.30 3 组胺 19.207 28.1004 3.2878 45.90 4 酪胺 23.083 10.6064 1.5952 21.20 5 亚精胺 23.756 10.3349 1.4422 13.90 6 精胺 27.211 6.1403 0.7895 14.10 5.3.6样品加标典型谱图及回收率 [min] 组分名称 鱼粉中组胺的含量(mg/kg) 加标量 测量值(mg/kg) 加标回收率(%) 平均加标回收率范围(%) 组胺 45.90 275.8 356.2 112.51 111.96-112.58 356.4 112.58 邮编： 317500 354.7 111.96 六、实验结果 方法验证结论：九种生物胺的精密度、线性相关系数、检出限、回收率结果汇总如下： 方法评价 组分名 保留时间/min 检出限(mg/kg) 峰面积 RSD (%) 线性相关系数 加标回收率范围(%) 色胺 14.071 0.5463 0.101 0.999 一 苯乙胺 16.368 0.3240 0.116 0.999 一 腐胺 17.426 0.3175 0.095 0.999 一 尸胺 18.517 0.3616 0.113 0.999 组胺 19.149 0.1685 0.148 0.999 111.96-112.58 章鱼胺盐酸盐 20.017 0.4093 0.108 0.999 一 酪胺 23.068 0.0476 0.09 0.999 亚精胺 23.748 0.3070 0.068 0.999 精胺 27.212 0.0774 0.105 0.999 由以上实验结果可知，采用福立LC5090 测定动物源性饲料中的生物胺，方法稳定可靠，目标物线性范围良好，灵敏度较高，有很好的重现性，能够对样品进行准确定性定量。