高效液相色谱法测定饲料中17种氨基酸

饲料中氨基酸种类以及含量是评价蛋白质品质的关键所在。本方案以鱼粉样品为样本，采用高效液相色谱仪测定其中17种氨基酸含量，形成评价该饲料中的蛋白质品质标准依据。蛋白质在盐酸作用下，水解成氨基酸，水解后的氨基酸和衍生试剂反应，形成稳定的黄色衍生物，经过色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。部分数据结果如下，下载可查看详细结果:17种氨基酸混标典型谱图1.天冬氨酸 2.谷氨酸 3.丝氨酸 4.精氨酸 5.甘氨酸 6.苏氨酸 7.脯氨酸 8.丙氨酸 9.缬氨酸10.蛋氨酸 11.胱氨酸 12.异亮氨酸 13.亮氨酸   14.苯丙氨酸 15.组氨酸 16.赖氨酸 17.酪氨酸鱼粉样品测定谱图1.天冬氨酸 2.谷氨酸 3.丝氨酸 4.精氨酸 5.甘氨酸 6.苏氨酸 7.脯氨酸 8.丙氨酸 9.缬氨酸10.蛋氨酸 11.胱氨酸 12.异亮氨酸 13.亮氨酸  14.苯丙氨酸 15.组氨酸 16.赖氨酸 17.酪氨酸浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法 一、检测方法： 参照标准： 《饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》 (DB41/T 1727-2018) 二、方法提要 蛋白质在盐酸作用下，水解成单一氨基酸，水解后的氨基酸和衍生试剂反应，形成稳定的黄色 衍生物，经过色谱柱分离，紫紫外检测器检测，外标法定量。 三、试剂和材料 3.1 乙腈：色谱纯 3.2 水：娃哈哈纯净水 3.3 17种氨基酸标准品：市售有证标准品 3.4 0.1mol/L盐酸溶液：取90pL浓盐酸(37%-38%))，，用水定容至10mL容量瓶中，混匀。 3.5 0.1mol/L 氢氧化钠溶液：称取 0.0403g氢氧化钠，用水定容至10mL容量瓶中，混匀 。 3.6 6mol/L 盐酸溶液：取50mL浓盐酸(37%-38%) ，加入水定容至100mL容量瓶中，混匀。 3.7 平衡缓冲液(PH=7)：称取 0.1380g磷酸二氢钾，加入5.82mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液，用水定容至 20mL容量瓶中，混匀。 3.8 衍生试剂：称取0.1107g2，4二 硝基氟苯，用乙腈定容至 10mL 容量瓶中，混匀。 3.9 衍生缓冲液：称取 0.2179g 碳酸氢钠，加入4.7mL水，超声溶解后，加入0.3mL乙腈， 混 匀。 3.10 50mmol/L 醋酸钠水溶液：取4.1g醋酸钠，加入1000mL水，配成混合溶液，用乙酸调至 PH=6.5左右 四、仪器和装置 4.1高效液相色谱仪：福立 LC5090 高效液相色谱仪，配备 LC5090在线脱气机、LC5090二元 高压输液泵、LC5090 自动进样器、LC5090 柱温箱、LC5090双波长-紫外检测器。 4.2分析天平：精度为 0.0001g。 4.3抽滤装置。 4.4水解管 4.5卡式气罐喷火烤枪 4.6过滤装置 4.7真空瓶 4.8真空泵(油泵) 4.9移液枪： 1mL， 200 pL， 50 uL 4.10微孔滤膜： 0.45 um 4.11烘箱 4.12蜗旋振荡器 4.13一般实验常用仪器和设备 五、实验 5.1标准系列溶液配制 5.1.1：标准使用溶液配制 5.1.1.1l级标准溶液配制 (100mg/L)取氨基酸标样((3.3) 250uL， 加入 250pL 0.1mol/L 盐酸溶液(3.4))，混匀，待衍生。 5.1.1.2Ⅱ级标准溶液配制 (50mg/L) 取|级标准溶液(5.1.1.1) 250uL， 加入 250uL 0.1mol/L 盐酸溶液(3.4)，混匀，待衍生。5.1.1.3Ⅲ级标准溶液配制 (25mg/L) 取Ⅱ级标准溶液(5.1.1.2) 250uL， 加入 250pL 0.1mol/L 盐酸溶液 (3.4))，混匀，待衍生。5.1.1.4IV级标准溶液配制 制(12.5mg/L)取Ⅲ级标准溶液 (5.1.1.3) 250uL， 加入250uL 0.1mol/L 盐酸溶液(3.4))，混匀，待衍生。 5.1.2：衍生反应 过程略 5.2样品制备 略 5.3仪器条件 略 5.4分析结果 5.4.117种氨基酸标准溶液典型谱图及结果(100mg/L) [min] 0 244 6 8 10 12 14 16 182022242628303223436 38 404244 46 4850 [min] 序号 组分名 保留时间/min 峰高/uAU 峰面积/uAU*S 理论塔板数 分离度 1 天冬氨酸 6.586 66993.6 641514.3 83840 0 2 谷氨酸 8.909 84300 631623.4 242758 11.049 3 丝氨酸 14.286 49574 581238.8 234344 21.934 4 精氨酸 17.225 53449.6 622725 381397 9.941 5 甘氨酸 18.163 51987.9 603702.5 392949 3.205 6 苏氨酸 18.594 57962.2 687129.9 445824 1.47 7 脯氨酸 20.628 44534.1 500442.6 594091 7.232 8 丙氨酸 21.634 57023.1 653358.2 628586 3.614 9 缬氨酸 28.657 59381.8 606846.4 1258323 25.811 10 蛋氨酸 30.3 56193.7 635308.5 1225956 6.028 11 胱氨酸 32.323 87680.6 1062939 1219846 6.938 12 异亮氨酸 33.701 41252 574835.2 926318 4.162 13 亮氨酸 34.538 38236 601562.6 807872 2.212 14 苯丙氨酸 36.739 80382.3 613863.9 3621033 7.401 15 组氨酸 36.978 74619.5 606488.7 3994570 1.227 16 赖氨酸 40.074 164108 1142533 6052393 17.279 17 酪氨酸 42.105 60788.2 587174.6 3425150 10.101 5.4.217种氨基酸标准溶6液六针重复性谱图及结果 (200mg/L) [min1 序号 组分名 平均保留时间/min 保留时间 RSD/% 平均峰面积/uAU*s 峰面积RSD/% 平均峰高/uAU 含量 RSD/% 1 天冬氨酸 6.578 0.251 665408.6 0.495 67008.2 0.491 2 谷氨酸 8.917 0.093 652570.6 0.379 85634.2 0.381 3 丝氨酸 14.304 0.078 604954.6 0.385 50347.1 0.38 4 精氨酸 17.246 0.059 638169.2 0.163 53902.5 0.148 5 甘氨酸 18.193 0.063 615394.8 0.249 51867.4 0.27 6 苏氨酸 18.629 0.071 703191.6 0.316 58637.5 0.345 7 脯氨酸 20.671 0.108 507906.3 0.185 45320.5 0.183 8 丙氨酸 21.675 0.071 665168.8 0.491 57025 0.485 9 缬氨酸 28.732 0.077 612077.5 0.309 59117 0.306 10 蛋氨酸 30.376 0.08 665129.1 0.337 57568.2 0.331 11 胱氨酸 32.409 0.089 1135632 0.237 86523.6 0.236 12 异亮氨酸 33.815 0.07 614359.2 0.395 41637 0.396 13 亮氨酸 34.667 0.065 613237.9 0.184 37586 0.181 14 苯丙氨酸 36.801 0.045 618815.4 0.309 81497.8 0.306 15 组氨酸 37.034 0.039 609426.7 0.187 77479.6 0.182 16 赖氨酸 40.125 0.053 1164031 0.211 166121.7 0.212 17 酪氨酸 42.173 0.071 607169.9 0.365 62148.6 0.356 邮编： 317500 5.4.3标准曲线 标准曲线的绘制：分别进样浓度为12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100mg/L、200 mg/L 的标 准系列溶液各10 uL， 进行 HPLC 分析。然后以目标物与内标的峰面积之比为纵坐标，以目标 物与内标的质量之比为横坐标，绘制标准曲线。 组 分[天冬氨酸 ]：：曲线方程： C i=0.0634404+1.23183E-005*Ai 校正因子 ：f 0=0.0634404， fl=1.23183E-005相关系数 ：r ^2=0.99962 组 分[谷氨酸 ]：曲线方程： Ci =-0.0595242+1.50259E-005*A i 校正因子： f 0=-0.0595242， f l =1.50259E-005相关系数 ：r *2=0.99961 组 分[丝氨酸]： 曲线方程： C i=0.0859751+1.06859E-005*Ai 校正因子： f 0=0.0859751， f l =1.06859E-005 相关系数 ：r ^2=0.99938 组 分[精氨酸]：曲线方程： Ci =0.168599+ 1.64912E-005*A i 校正因子： f 0=0.168599， f l =1.64912E-005相关系数 ：r `2=0.99945 组 分[甘氨酸 ]：曲线方程： C i=0.0478514+7.34951E-006*A i 校正因子 ： f 0=0.0478514， f l =7.34951E-006 相关系 数 ：r2=0.99980 C i [mg /L ] 组 分 [苏氨酸 ]：曲线方程：C i=0.0879052+1.02431E-005*Ai 校正因子 ：f 0=0.0879052， f l =1.02431E-005相关系数 ：r2=0.99968 750，000 组 分[脯氨酸 ]：曲线方程： C i=0.0834804+1.3577E-005*A i 校正因子： f 0=0.0834804， f l =1.3577E-005 相关系数：r ^2=0.99982 550.000 组 分[丙氨酸]：曲线方程： Ci= 0.0668736 +8.0427E-006*Ai 校正因子 ： f0=0.0668736，f 1=8.0427E-006 相关系数 ：r ^2=0.99970 组 分 [缬氨酸 ]： 曲线方程： Ci=0.0785691 +1.12784E-005*A i 校 正因子 ： f 0=0.0785691. fl=1.12784E-005相关系数：r ^2=0.99906 组 分[蛋氨酸 ]：曲线方程： C i=0.153103 +1.34248E-005*Ai 校正因子： f 0=0.153103， f l =1.34248E-005相关系数 ：r ^2=0.99968 C i [mg /L ] 组 分[胱 氨酸 ]： 曲线方程： C i=0.0413774+1.3395E-005*A i 校 正因子 ： f0=0.0413774， f l =1.3395E-005 相关系数 ：r ^2=0.99994 组 分[异亮氨酸 ]：曲线方程： Ci =-0.0270295+1.35314E-005*Ai 校正因子 ：f 0=-0.0270295， fl=1.35314E-005相关系 数 ： r *2=0.99938 组 分 [亮氨酸 ]：曲线方程： C i =0.118249+1.26887E-005*A i 校正因子 ： f 0=0.118249， f l =1.26887E-005 相关系数 ： r ^2=0.99955 组 分[苯丙氨酸 ]：曲线方程： C i=0.0853324+1.59525E-005*Ai 校正因子： f0=0.0853324， fl=1.59525E-005相关系数 ： r2=0.99972 组 分 [组氨酸 ]：：曲线方程： Ci=0.230942+1.49052E-005*Ai 校 正因子 ： f 0=0.230942， fl=1.49052E-005 相 关 系数 ：r ^2=0.99948 组 分[赖氨酸 ]：曲线方程： C i =-0.059854+7.70986E-006*A i 校正因子 ： f0=-0.059854， f l =7.70986E-006相 关 系数 ：r ^2=0.99953 Ci [mg /L ] 组 分[酪氨酸 ]：日 曲线方程： Ci=0.256511+1.80713E-005*Ai 校正因子： f 0=0.256511， fl=1.80713E -005 相关系数 ：r2=0.99924 5.4.4检出限 [min] 序号 组分名 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 检出限% 定量限 % 1 天冬氨酸 0.1483 0.1433 0.1377 0.1361 0.1427 0.1417 0.143 0.0126 0.0503 2 谷氨酸 0.0436 0.0258 0.0217 0.0241 0.0271 0.0265 0.0224 0.0234 0.0938 5 二 二 CO CO O) 赖氨酸 组氨瑟 苯丙氨酸 亮氨酸 ww O16 O15 ONO 160 OO ON6 0.3373 11 ON 14 OOw O O5w O Ow O16 0.3384 ONoN 15 1 O 1 ON 5 O4 O 00 00 15(O O 16 OOO O Ow O1N 090 O 1 夕 07 口 芯 OO O1 O .O O O w w O16N O ON O O141 O OO O5 9N 154 5 O1 O O O5 O1 19 OOO OO 000 1N 00 O ON5 5 000 1 004 OO [1]天冬氨酸 6.564 [2]谷氨酸 8.901 产 [3]丝氨酸 14.305 14]精氨酸 17.221 [655拐甚霞81路0168 [7]脯氨酸 20.635[8]丙氨酸 21.642 [9]缬氨酸 28.676 [10]蛋氨酸 30.335 111胱氨酸 32.338 异03亮氨酸 33.744亮氨酸 34.582 二 儿博弈绩懒晚.302764 [16]赖氨酸 40.089 [17]酪氨酸 42.132 品 痂爬画3 FUL 浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 1 天冬氨酸 6.587 485978.9 48794.7 6.0298 2 谷氨酸 8.899 620242 80028.5 9.2294 3 丝氨酸 14.323 209806.2 17211.3 2.3202 4 精氨酸 17.272 223785.7 18865 3.8463 5 甘氨酸 18.217 597474.7 48756.4 4.4242 6 苏氨酸 18.682 268460.1 21216.4 2.8283 7 脯氨酸 20.75 212633.1 18787.2 2.9605 8 丙氨酸 21.725 515649.7 44841.9 4.2001 9 缬氨酸 28.836 288674.8 28099.5 3.3233 10 蛋氨酸 30.485 136338.8 11638 1.9768 11 胱氨酸 32.554 26757.3 1388.7 0.3985 12 异亮氨酸 33.982 204773.6 14408.7 2.7347 13 亮氨酸 34.842 355840.4 22188.4 4.618 14 苯丙氨酸 36.891 164890 21886.4 2.7067 15 组氨酸 37.11 115011.8 16163 1.9388 16 赖氨酸 40.199 712502.5 96214.7 5.4154 17 酪氨酸 42.266 98057.6 10557.9 2.0218 鱼粉中的氨基酸总含量/% 60.9728 5.4.5.1样品结果比对 序号 组分名 氨基酸分析仪结果/% 液相色谱仪(含紫外检测器)结果/% 某三方检测 某三方检测 福立仪器 1 天冬氨酸 5.94 6.03 5.85 2 谷氨酸 8.89 9.23 8.90 3 丝氨酸 2.13 2.32 2.04 4 精氨酸 3.84 3.85 3.85 5 甘氨酸 4.37 4.42 4.64 海 回 贯 …15 浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 10.1905 105.29 谷氨酸 9.2294 4.7053 14.5332 112.72 106.11-112.72 14.2223 106.11 14.0621 108.91 丝氨酸 2.3202 3.1937 5.4947 99.40 94.97-109.48 5.3532 94.97 5.8491 109.48 精氨酸 3.8463 5.2975 9.0445 98.13 93.64-99.55 8.8068 93.64 9.4922 99.55 甘氨酸 4.4242 2.2536 6.8743 108.72 102.86-108.72 6.7423 102.86 6.8829 108.25 苏氨酸 2.8283 3.6343 6.425 98.97 93.99-100.26 6.2443 93.99 6.4207 100.26 脯氨酸 2.9605 3.5321 6.4406 98.53 93.08-98.53 6.2481 93.08 6.6435 95.11 丙氨酸 4.2001 2.7449 7.1055 105.85 98.30-107.46 6.8984 98.30 6.9766 107.46 缬氨酸 3.3233 3.5135 6.8519 100.43 98.60-113.66 6.7876 98.60 6.8368 113.66 蛋氨酸 1.9768 4.56 6.4198 97.43 93.40-97.43 6.2359 93.40 6.8951 94.22 胱氨酸 0.3985 7.1618 7.7069 102.05 95.04-102.05 7.2053 95.04 7.7167 97.63 异亮氨酸 2.7347 3.8093 7.0972 114.52 103.18-114.52 6.7281 104.84 7.3108 103.18 亮氨酸 4.618 4.0373 8.64401 99.72 93.14-104.59 8.3785 93.14 地址：浙江温岭城东街道百丈南路95号 邮编： 317500 9.0024 104.59 苯丙氨酸 2.7067 5.032 7.5191 95.64 89.72-98.62 7.2212 89.72 8.0235 98.62 组氨酸 1.9388 4.3392 5.8583 89.87 84.85-104.34 5.6208 84.85 6.6635 104.34 赖氨酸 5.4154 4.4323 10..0188 103.86 98.19-110.08 9.7674 98.19 9.6791 110.08 酪氨酸 2.0218 5.4535 7.3485 97.67 91.84-100.20 7.03305 91.84 7.4588 100.20 注：以称样量为0.2g， 定容体积为 1050mL计 六、实验结果 方法验证结论：氨基酸的精密度、线性相关系数、检出限、回收率结果汇总如下： 方法评价 组分名 检出限% 定量限% 峰面积 RSD (%) 线性相关系数 加标回收率范围(%) 天冬氨酸 0.0126 0.0503 0.495 0.99962 102.99-107.58 谷氨酸 0.0234 0.0938 0.379 0.99961 106.11-112.72 丝氨酸 0.0053 0.0210 0.385 0.99938 94.97-109.48 精氨酸 0.0162 0.0647 0.163 0.99945 93.64-99.55 甘氨酸 0.0010 0.0040 0.249 0.99980 102.86-108.72 苏氨酸 0.0025 0.0098 0.316 0.99968 93.99-100.26 脯氨酸 0.0037 0.0149 0.185 0.99982 93.08-98.53 丙氨酸 0.0060 0.0239 0.491 0.99970 98.30-107.46 缬氨酸 0.0084 0.0338 0.309 0.99906 98.60-113.66 蛋氨酸 0.0022 0.0088 0.337 0.99968 93.40-97.43 胱氨酸 0.0201 0.0805 0.237 0.99994 95.04-102.05 异亮氨酸 0.0054 0.0215 0.395 0.99938 103.18-114.52 地址：浙江温岭城东街道百丈南路95号 邮编： 317500 浙江福立分析仪器股份有限公司应用中心 亮氨酸 0.0076 0.0304 0.184 0.99955 93.14-104.59 苯丙氨酸 0.0109 0.0437 0.309 0.99972 89.72-98.62 组氨酸 0.0421 0.1685 0.187 0.99948 84.85-104.34 赖氨酸 0.0043 0.0173 0.211 0.99953 98.19-110.08 酪氨酸 0.0041 0.0166 0.365 0.99924 91.84-100.20