化妆品中26种防腐剂检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-764Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-604 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法测定化妆品中水杨酸等26种防腐剂 LCMSMS-604 摘要：本文建立了使用岛津超高效液相色谱串联质谱联用仪测定化妆品中26种防腐剂的方法。化妆品样品采用甲醇提取， LC-MS/MS分析。26种防腐剂在 15 min 时间内分析完成，部分同分异勾体分离良好。26种防腐剂在指定的浓度范围内线性关系良好，仪器检出限为0.2~20 ng/mL。加标回收和精密度实验测试表明，方法准确度高，重复性好。该方法快速、有效，，可应对化妆品中常见防腐剂的风险监测需求。 关键词：超高效液相色谱三重四极杆质谱 化妆品 防腐剂 化妆品防腐剂是指以抑制微生物在化妆品中的生长和繁殖为目的而在化妆品中加入的物质。常见的化妆品中防腐剂有羟苯酯类、苯氧乙醇类、咪唑烷基脲类、甲基异噻唑啉酮(卡松)、苯甲醇类、1、1，2-二元醇类和布罗波尔等。由于化妆品的保质期通常较长，许多化妆品离不开防腐剂，特别是液态水基类化妆品。然而，一些不法厂家肆意过量地添加化妆品，可能给使用者带来安全隐患，如卡松可能对皮肤产生刺激作用，羟苯酯类可能会影响激素的分泌、布罗波尔类可能会导致致癌物质亚硝胺的产生。 《化妆品安全技术规范》(2015年版))1中列出了化妆品中51种准用防腐剂，并规定了每一种防腐剂的最大使用限量和使用范围，因此需要开发合适的检测 实验部分 方法进行化妆品中防腐剂的准确定量。另外，部分化妆品中实际防腐剂成分和外包装上标识成分不一致，这可能暗示着该化妆品生产过程中存在违规操作的可能，因此准确的防腐剂定性确证方法也必不可少。 化妆品中防腐剂的检测方法包括 LC 法、GC 法、LCMSMS 法和 GCMS 法等。2021年3月国家药品监督管理局发布《化妆品中防腐剂检验方法》 (2021年第17号通告)，其中包括了《化妆品安全技术规范》中51种准用防腐剂的检测方法。 本文参照该通告中的方法，建立了 LC-MS/MS 法测定化妆品中26种防腐剂的方法。该方法快速、准确，可以很好地应对化妆品中防腐剂的快速筛查、定性确证和定量分析。 1.1化合物信息 表1 化合物信息 序号 中文名称 英文名称 CAS 分子式 分子量 对应(2021 年第17号公 告)中的方法 水杨酸 Salicylicacid 69-72-7 C-H03 138.03 4.2 2 甲基异噻唑啉酮 Methylisothiazolinone 2682-20-4 C4H，NOS 115.01 4.1 3 苯甲酸 Benzoic acid 65-85-0 C，H，COOH 122.04 4.1 4 2-溴-2硝基丙烷-1，3-二醇 2-Bromo-2-nitro-1，3-pro- panediol 52-51-7 CH，BrNO 198.95 4.1 5 4-羟基苯甲酸 4-Hydroxybenzoic acid 99-96-7 C-H，03 138.03 4.1 6 脱氢乙酸 Dehydroacetic acid 520-45-6 CgHg04 168.04 4.1 7 甲基氯异噻唑啉酮 METHYLCHLOROISOTHI- AZOLINONE 26172-55-4 C4HCINOS 148.97 4.1 8 硫柳汞钠 Thimerosal 54-64-8 C，HHg NaO，S 404.81 4.2 序号 中文名称 英文名称 CAS 分子式 分子量 对应 (2021 年第17号公 告)中的方法 9 4-羟基苯甲酸甲酯 Methylparaben 99-76-3 CHg0： 152.05 4.1 10 4-羟基苯甲酸乙酯 Ethylparaben 120-47-8 CgH1003 166.06 4.1 11 4-羟基苯甲酸异丙酯 Isopropylparaben 4191-73-5 C10H1203 180.08 4.1 12 对氯间甲酚 4-Chloro-3-methylphenol 59-50-7 C-H-CIO 142.58 4.2 13 碘丙炔醇丁基氨甲酸酯 lodopropynyl butylcarba- mate 55406-53-6 CgH12INO， 280.99 4.2 14 4-羟基苯甲酸丙酯 Propylparaben 94-13-3 C10H1203 180.08 4.1 15 4-羟基苯甲酸苯酯 Phenylparaben 17696-62-7 C13H100： 214.06 4.1 16 邻苯基苯酚 2-Phenylphenol 90-43-7 C12H100 170.21 4.2 17 氯二甲酚 4-Chloro-3，5-dimethylphe- nol 88-04-0 CgHCIO 156.61 4.2 18 4-羟基苯甲酸异丁酯 Isobutylparaben 857259 C11H140： 194.09 4.1 19 4-羟基苯甲酸丁酯 Butylparaben 94-26-8 C11H1403 194.09 4.1 20 4-羟基苯甲酸苄酯 Benzylparaben 94-18-8 C14H120： 228.08 4.1 21 氯咪巴唑 Climbazole 38083-17-9 C15H17CIN202 292.76 4.2 22 4-羟基苯甲酸戊酯 4-HYDROXYBENZOIC ACID N-AMYLESTER 6521-29-5 C12H160： 208.11 4.1 23 苄氯酚 Clorofene 120-32-1 C13H1OCI 218.68 4.2 24 溴氯酚 BROMOCHLOROPHEN 15435-29-7C13HgBrzClz20z 423.83 4.2 25 三氯卡班 Triclocarban 101-20-2 C13H，ClN20 313.98 4.2 26 三氯生 Triclosan 3380-34-5 C12H-CI30， 287.95 4.2 1.2仪器 本实验采用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与 LCMS-8050 联用系统，具体配置为： 系统控制器：CBM-20A 脱气机： DGU-20A 输液泵： LC-30AD×2 自动进样器：SIL-30AC柱温箱： CTO-20A 质谱检测器：LCMS-8050 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.97 1.3分析条件 液相条件： 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (50 mm x2.1 mml.D.，2um，岛津(上海)实验器材有限公司， PN：227-30001-02) 流动相：A相-5mM乙酸铵水溶液；B相-甲醇 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱程序见表2 流速：0.3 mL/min 进样量：2uL 柱温：40C 表2 梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 1.00 泵 B.Conc 10 2.00 泵 B.Conc 50 4.00 泵 B.Conc 50 5.00 泵 B.Conc 55 8.00 泵 B.Conc 55 11.00 泵 B.Conc 90 12.00 泵 B.Conc 90 12.10 泵 B.Conc 10 15.00 Controller Stop 质谱条件： 接口温度：300℃ 分析仪器：LCMS-8050 DL温度：250℃ 离子化模式： ESI+/-同时扫描 加热模块温度：400℃ 离子源接口电压：4.0kV 扫描模式：多反应监测(MRM) 雾化气：氮气3.0 L/min 驻留时间： 30ms 干燥气：氮气10.0L/min 延迟时间：3ms 碰撞气：氩气 表3 MRM优化参数 No. 化合物 离子化方式 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 水杨酸 136.90 116.00 92.90* 15 18 10 65.00 15 30 24 2 十 甲基异噻唑啉 100.90* -12 -22 -19 酮 84.90 -12 -24 -17 77.00* 15 11 10 3 苯甲酸 121.00 120.00 14 14 14 4 170.00 2-臭-2硝基 87.90* 13 11 18 丙烷-1，3-二 醇 80.80 13 23 24 92.90* 15 18 10 5 136.90 4-羟基苯甲酸 65.00 15 30 24 6 脱氢乙酸 167.10 83.00* 17 15 16 123.00 12 12 13 7 十 150.00 甲基氯异噻唑 86.90* -11 -38 -17 啉酮 58.00 -10 -30 -23 8 硫柳汞 383.10 108.05* 11 25 21 339.15 11 13 23 注：*表示定量离子 1.4标准品的配制 26种防腐剂储备容液分别来源于岛津上海实验器材有限公司和客户，溶剂为甲醇。 混合标准中间液：准确移取适量储备液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为2500 ng/mL(以水杨酸计)的混合标准中间溶液。 标准曲线配制：以50%甲醇水为溶剂，将混合标准中间液逐级稀释至浓度为0.5、1、2、20、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL(以水杨酸计)的标准点，上机分析。 1.5样品前处理方法 准确称取样品1.0 g，置于具塞比色管中，加入8mL甲醇，涡旋混匀，超声提取20 min， 用甲醇定容至10mL，摇匀。取上清液5 mL 于10mL容量瓶中，用水定容，混匀。样液以10000 r/min 的转速离心5 min， 经0.22um 滤膜过滤后，上机分析。 结果与讨论 2.126种防腐剂色谱图 Q165.00>92.00 (-) 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0e0 Ｑ141.10>35.00(-) 3.0e4- 2.0e4 1.0e4 0.0e0· Q169.20>115.05(-) 1.5e4 1.0e4 5.0e3 0.0e0· Q193.00>92.10 (-) 8.0e5·-3 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0e0 Q207.10>92.00 (-) 3.0e6- 2.0e6 1.0e66- 0.0e00- 1.75e5 7.0 3.63e5 RT=7.227 8.0 8.85e5 RT=8.072 2.36e6 10.5 9.34e5 ：RT=11.424 12.0 图1 26种防腐剂MRM 色谱图 2.2线性范围 按照1.4项下配制方法，配制标准曲线。以化合物浓度X为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，26种防腐剂在指定浓度内线性良好，相关系数均大于0.995。以标准曲线浓度最低点使用3倍信噪比的方式计算检出限，26种防腐剂的检出限为0.2~20 ng/mL。 图2 防腐剂标准曲线(部分) 表4 26种防腐剂标准曲线参数 No. 化合物 线性范围 (ng/mL) 相关系数 加权系数 准确度 (%) 检出限 (ng/mL) 1 水杨酸 5~500 0.9998 无 95~105 2 2 甲基异噻唑啉酮 2~500 0.9997 1/C 91~108 0.5 3 苯甲酸 25~2500 0.9998 无 93~109 15 4 2-溴-2硝基丙烷-1，3- 二醇 10~4000 0.9962 1/C 91~108 2 5 4-羟基苯甲酸 25~1500 0.9992 无 95~105 10 6 脱氢乙酸 10~2500 0.998 1/C 92~111 2 甲基氯异噻唑啉酮 2~500 0.9993 1/C 91~108 0.5 8 硫柳汞钠 50~2500 0.9994 无 93~105 20 9 4-羟基苯甲酸甲酯 2~500 0.9989 1/C 89~108 10 4-羟基苯甲酸乙酯 1~500 0.9993 1/C 88~108 0.5 11 4-羟基苯甲酸异丙酯 1~500 0.9992 1/C 89~109 0.5 12 碘丙炔醇丁基氨甲酸酯 2~500 0.9987 1/C 98~106 0.5 13 对氯间甲酚 25~2500 0.9983 1/C 89~107 5 14 4-羟基苯甲酸丙酯 1~500 0.9986 1/C 93~107 0.5 15 4-羟基苯甲酸苯酯 5~1000 0.9965 1/C 87~108 1 16 邻苯基苯酚 25~2500 0.9997 无 95~107 10 17 氯二甲酚 25~2500 0.9992 无 91~105 10 18 4-羟基苯甲酸异丁酯 1~500 0.9998 无 97~106 0.5 19 4-羟基苯甲酸丁酯 1~500 0.9996 无 92~109 0.5 20 4-羟基苯甲酸苄酯 1~500 0.9988 1/C 97~110 0.5 21 氯咪巴唑 0.5~500 0.9984 1/C 92~108 0.2 22 4-羟基苯甲酸戊酯 0.5~500 0.9988 1/C 94~109 0.2 23 苄氯酚 5~500 0.9984 1/C 95~113 2 24 三氯卡班 0.5~500 0.9988 1/C 97~109 0.2 25 溴氯酚 0.5~500 0.9973 1/C 92~114 0.2 26 三氯生 5~500 0.9981 1/C 91~106 2 2.3重复性 对100 ng/mL (以水杨酸计)混合标准溶液连续分析6次，计算重复性。结果见表5。26种化合物的保留时间 RSD 为 0.02~0.31%，峰面积 RSD 为 0.79%~5.91%，重复性良好。 表5)26种防腐剂重复性结果(n=6) 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 No. 化合物 RSD， % RSD， % No. 化合物 RSD， % RSD，% 1 水杨酸 0.23 2.49 14 4-羟基苯甲酸苯酯 0.16 1.93 2 甲基异噻唑啉酮 0.31 5.91 15 4-羟基苯甲酸丙酯 0.16 1.93 3 苯甲酸 0.16 3.71 16 邻苯基苯酚 0.14 4.71 No. 化合物 保留时间 RSD， % 峰面积 RSD，% No. 化合物 保留时间 RSD，% 峰面积 RSD，% 4 2-溴-2硝基丙 烷-1，3-二醇： 0.25 2.46 17 氯二甲酚 0.21 4.04 5 4-羟基苯甲酸 0.21 2.56 18 4-羟基苯甲酸异丁 酯 0.14 1.13 6 脱氢乙酸 0.22 4.91 19 4-羟基苯甲酸丁酯 0.14 1.34 7 甲基氯异噻唑啉酮 0.11 5.44 20 4-羟基苯甲酸苄酯 0.18 1.81 8 硫柳汞钠 0.06 2.35 21 氯咪巴唑 0.04 1.13 9 4-羟基苯甲酸甲酯 0.07 2 22 4-羟基苯甲酸戊酯 0.04 0.79 10 4-羟基苯甲酸乙酯 0.1 1.22 23 苄氯酚 0.04 4.54 11 4-羟基苯甲酸异丙 酯 0.1 1.6 24 三氯卡班 0.02 1.22 12 碘丙炔醇丁基氨甲 酸酯 0.08 2.61 25 溴氯酚 0.02 1.86 13 对氯间甲酚 0.14 4.39 26 三氯生 0.02 3.95 2.4方法准确性和精密度 取某品牌柔肤水，按照1.5前处理方式进行处理，样品中检出水杨酸和4-羟基苯甲酸甲酯，浓度分别为6.1mg/kg 和 498 mg/kg。 向样品中添加浓度为 0.5、5.0 mg/kg (以甲基异噻唑啉酮计)2个水平的加标量，每个水平重复3次，进行加标回收率和精密度试验。其中水杨酸的低浓度点和4-羟基苯甲酸甲酯因为本底浓度远高于加标浓度，没有计算回收率。表6为实验结果，25种化合物的平均回收率为 83.3%~108%，相对标准偏差为1.96%~9.33%。 表6 26种防腐剂加标回收和精密度结果(n=3) No. 化合物 样品浓度 (mg/kg) 添加浓度(mg/ kg) 平均回收率(%) 相对标准偏差 RSD% 水杨酸 6.1 5 89.1 4.41 2 甲基异噻唑啉酮 N.D. 0.5 84.3 2.59 5 85.9 3.70 3 苯甲酸 N.D. 4 90.3 8.31 40 95.6 3.17 4 N.D. 2-溴-2硝基丙烷-1，3- 12.5 92.8 4.33 二醇 125 84.1 2.90 1.5 83.8 3.62 5 4-羟基苯甲酸 N.D. 15 85.4 2.62 6 脱氢乙酸 N.D. 2.5 91.7 7.04 25 102.6 3.33 甲基氯异噻唑啉酮 N.D. 0.5 87.7 3.32 5 96.1 2.35 8 硫柳汞钠 N.D. 5 93.1 5.57 50 105 4.77 2.5实际样品测试 取某品牌洗发水和护发素，按照1.5的前处理方式处理后上机测试。测试结果见表7，两种样品的色谱图如图3、图4所示。测试出的防腐剂种类与产品外包装相符。 min 图3 某洗发水提取液 TIC色谱图和检出防腐剂 MRM 色谱图 图4 某护发素提取液 TIC 色谱图和检出防腐剂 MRM 色谱图 表7 实际样品中防腐剂测试结果 检出化合物 含量 标准样品离 允许偏差范 样品离子丰 样品名称 编号 化合物名称 (mg/kg) 子丰度比(%) 围(%) 度比(%) 洗发水 护发素 2 甲基异噻唑啉酮 0.68 49.79 40.39-60.58 46.56 7 甲基氯异噻唑啉酮 1.88 47.30 36.01-60.02 43.67 9 4-羟基苯甲酸甲酯 2.68 15.20 10.05-18.67 15.68 9 4-羟基苯甲酸甲酯 1.36 15.20 10.05-18.67 16.32 12 碘丙炔醇丁基氨甲酸酯 82.9 64.51 50.85-76.27 69.41 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱串联质谱联用仪测定化妆品中常见的26种防腐剂含量的方法。方法参照国家药品监督管理局发布《化妆品中防腐剂检验方法》 (2021年第17号通告)中的方法，其中26个化合物包括了公告中《4.1甲基异噻唑啉酮等23个组分》 LCMSMS确证部分的15个化合物、以及《4.2吡硫鑰锌等19个组分》LCMSMS 确证部分的11个化合物。该方法在15 min 内完成26种防腐剂的检测。方法采用外标法定量，各化合物在指定浓度范围内相关系数均大于0.995，检出限为0.2~20 ng/mL。样品采用甲醇提取后上机分析。加标结果显示防腐剂化合物在0.5、5.0 mg/kg(以水杨酸计)2个浓度水平下，平均回收率为83.3%~108%，相对标准偏差为1.96%~9.33%。该方法已成功的应用于实际样品中防腐剂的检测，结果与样品外包装标识成分一致。本文所建立的方法快速、有效，可应对化妆品中常见防腐剂的日常风险监测和阳性确证工作。 岛津应用云 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱串联质谱联用仪测定化妆品中常见的26种防腐剂含量的方法。方法参照国家药品监督管理局发布《化妆品中防腐剂检验方法》（2021年第17号通告）中的方法，其中26个化合物包括了公告中《4.1 甲基异噻唑啉酮等23个组分》LCMSMS确证部分的15个化合物、以及《4.2 吡硫鎓锌等19个组分》LCMSMS确证部分的11个化合物。该方法在15 min内完成26种防腐剂的检测。方法采用外标法定量，各化合物在指定浓度范围内相关系数均大于0.995，检出限为0.2~20 ng/mL。样品采用甲醇提取后上机分析。加标结果显示防腐剂化合物在0.5、5.0 mg/kg（以水杨酸计）2个浓度水平下，平均回收率为83.3%~108%，相对标准偏差为1.96%~9.33%。该方法已成功的应用于实际样品中防腐剂的检测，结果与样品外包装标识成分一致。本文所建立的方法快速、有效，可应对化妆品中常见防腐剂的日常风险监测和阳性确证工作。