化妆水中41种糖皮质激素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-095Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-398 http：//www.shimadzu.com.cn 岛津LCMS-8050定定爽肤水41种糖皮质激素 LCMSMS-398 摘要：本文参考 GB/T 24800.2-2009《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定-液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》，建立岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050 测定爽肤水中41种糖皮质激素的分析方法。本方法在确保质谱离子对与国家测试标准一致的基础上，使用岛津 LC-30A 超高效液相系统，成功实现41种糖皮质激素，特别是同分异构体地塞米松和倍他米松等化合物的液相分离。该方法灵敏度高，41种糖皮质激素中除氟氢缩松的仪器检出限为0.8 ug/L外，其他物质的仪器检出限均小于0.5 ug/L， 大大优于国家标准的检测灵敏度。在精密度方面，41种糖皮质激素的保留时间相和峰面积的相对标准偏差分别在 0.02%~0.53%和0.42%~6.39%之间，仪器精密度良好。爽肤水在不同的基基加标浓度下的回收率在80.1%-113.6%之间，符合化妆品实际测试情况。该分析方法灵敏度高，可以满足化妆品中糖皮质激素的检测要求。 关键词：糖皮质激素爽肤水三重四极杆质谱 糖皮质激素 (Glucocorticoids)是一类具有消炎及免疫抑制等药理作用的甾体激素，是临床上用于治疗过敏性及炎症性疾病的最常见药物。用在化妆品上可以抑制纤维细胞增生，短时间使用可使皮肤光滑细腻、红润白嫩，对皮肤具有一定的嫩白作用，但长期使用该类激素会导致皮肤血管扩张、激素依赖性皮炎及不可逆转的皮肤萎缩等局部副作用，甚至可引起骨质疏松症、高血压及糖尿病等严重系统性损伤。我国现行《化妆品安全技术规范》 (2015年版)及欧盟化妆品指令 76/768/EEC 等法规明确规定，禁止在化妆品中添加糖皮质激素。然而，仍有厂家非法将其添加 到化妆品中，使皮肤达到速效祛痘美白的效果，由此造成的化妆品安全事故频繁发生，引起社会广泛关注。因此，建立一种简便高效的分析检测方法，对化妆品行业监管及保障消费者安全具有重要意义。目前，液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 法因具有高选择性、高灵敏度等特点而成为分析糖皮质激素的主要方法。 本文参考国家化妆品检测标准 GB/T24800.2-2009《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定-液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》，采用岛津 LCMS-8050三重四极杆液质联用仪建立测定爽肤水样品中41种糖皮质激素的分析方法。 I实验部分 1.1仪器 本实验使用 LCMS-8050三重四极杆液质联用系统。具体配置为 LC-30AD输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC自动进样器， CTO-30A柱温箱，CBM-20A系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.96 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 2.1 mmI.D.× 100 mm L.， 2.7 um 流动相：A相-水(0.1%乙酸)；；B相-乙乙(0.1%乙酸) 流速：0.45 mL/min 柱温：40C 进样体积：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为25%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 质谱条件 离子化模式：ESI(+) 雾化气流速：3.0L/min 加热气流速：10.0L/min 干燥气流速：10.0L/min 接口温度：300℃ 加热模块温度：400℃ DL温度：250℃ 碰撞气：氩气270kPa MRM参数：见表2 表2MRM参数 CAS 前体 产物 Q1Pre CE Q3Pre No. 中文名称 英文名称 No. 离子 离子 Bias(V) (V) Bias(V) 225.15* -11 -18 -16 1 曲安西龙 Triamcinolone 124-94-7 395.00 357.10 -16 -14 -26 147.15* -18 -23 -16 2 泼尼松龙 Prednisolone 50-24-8 361.30 343.15 -18 -11 -17 3 泼尼松 Prednisone 53-03-2 359.25 147.15* -14 -25 -16 341.15 -14 -12 -17 4 氢化可的松 Hydrocortisone 50-23-7 363.30 121.10* -27 -25 -24 105.20 -11 48 -12 5 可的松 Cortisone 53-06-5 361.30 163.20* -18 -24 -18 121.10 -18 -30 -13 357.20* -14 -11 -26 6 甲基泼尼松龙 ，1 Methylprednisolone 83-43-2 375.25 161.15 -11 -25 -18 355.20* -19 -12 -18 7 倍他米松 Betamethasone 378-44-9 393.30 147.05 -12 -28 -25 8 氟米松 Flumethasone 2135-17-3 411.30 253.15* -21 -17 -28 121.15 -12 -33 -13 LCMSMS-398 28 曲安奈德 Triamcinolone 3870-07-3 477.30 321.20* -14 -19 -16 醋酸酯 acetonide acetate 339.10 -23 -15 -17 29 氟轻松醋酸酯 Fluocinonide 356-12-7 495.30 121.15* -14 -39 -13 337.15 -14 -17 -25 30 二氟拉松双 Diflorasone diacetate 33564-31-7 495.30 317.20* -12 -14 -16 醋酸酯 279.15 -18 -17 -20 31 倍他米松戊 Betamethasone 2152-44-5 477.30 355.20* -14 -12 -18 酸酯 17-valerate 279.20 -14 -19 -20 32 哈西奈德 Halcinonide 3093-35-4 455.20 121.15* -22 -43 -13 105.10 -14 -54 -18 33 泼尼卡酯 Prednicarbate 73771-04-7 489.30 115.20* -14 -16 -12 381.20 -18 -12 -19 34 安西奈德 Amcinonide 51022-69-6 503.20 321.00* -26 -19 -15 339.20 -24 -17 -17 35 阿氯米松双丙 Alclomethasone 66734-13-2 521.20 301.20* -20 -18 -15 酸酯 dipropionate 279.05 -26 -20 -30 36 氯倍他索丙 Clobetasol 25122-46-7 467.30 355.15* -23 -14 -25 酸酯 17-propionate 373.20 -11 -12 -14 80474-14-2 37 氟替卡松丙 Fluticasone 501.10 293.05* -26 -18 -15 酸酯 propionate 313.00 -26 -14 -16 38 莫米他松糠 Mometasone furoate 83919-23-7 521.20 503.05* -20 -13 -26 酸酯 263.20 -20 -26 -19 39 倍他米松双丙 Betamethasone 5593-20-4 505.30 279.10* -20 -20 -20 酸酯 dipropionate 319.20 -20 -17 -16 40 倍氯米松双丙 Beclomethasone 5534-09-8 521.15 319.20* -20 -17 -16 酸酯 dipropionate 502.90 -24 -13 -38 41 氯倍他松丁 Clobetasone 25122-57-0 479.30 279.10* -14 -19 -21 酸酯 17-butyrate 343.15 -14 -18 -13 *定量离子对 l样品前处理 2.1标准溶液配制 用甲醇将41种糖皮质激素的单标储备溶液配制成浓度为20 mg/L 的混合储备溶液，再用25%乙腈水溶液依次稀释成浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200.0ug/L的标准工作液，用于建立标准曲线。 2.2样品制备 参照 GB/T24800.2-2009中的样品处理方法，称取0.2g爽肤水样品于10 mL逆塞塑料离心管中，加3mL饱和氯化钠，漩涡混合，再加入2mL乙腈，充分涡旋2 min， 12000 r/min 离心10 min，吸出上层清液于另一50mL具塞塑料离心管中，下层氯化钠溶液再用2mL乙腈重复提取步骤一次，合并二次乙腈提取取， 往提取液中准确加入40 mL超纯水，混匀，加入10%亚铁氰化钾溶液0.2mL， 混匀，加入20%乙酸锌溶液0.2mL， 混匀，12000 r/min 离心 10 min，上清液待使用HLB 固相萃取小柱净化。最终使用4.0 mL甲醇淋洗HLB小柱，并加入超纯水定容至10mL，用0.22 um 滤膜过滤待机测试。 l结果与讨论 3.1MRM 色谱图与同分异构体的分离 在41种糖皮质激素(MRM色谱图见图1)中，有几组物质互为同分异构体，分离难度较大，特别是互为顺反异构的地塞米松和倍他米松(结构见图2)，以及存在R型和S型的两种差向异构体的布地奈德(Budesonide， 简称BUD，结构见图4)，在GB/T24800.2-2009 及众多的分析测试文献中，以上化合物在单个液相方法中较难实现分离，本方法选择高柱效色谱柱，通过液相梯度条件优化，成功将地塞米松和倍他米松 (MRM色谱图见图3)、布地奈德R型和S型(MRM色谱图见图5)两种同分异构体实现液相分离。在此实验中由于没有布地奈德差向异构体的标准品，无法通过实验准确确认其中峰的归属，在此仅参考相关文献进行峰归属的确认，在定量上也参照 GB/T24800.2-2009，将布地奈德的R型和S型合并计算。 图141种糖皮质激素标准溶液 MRM 色谱图(10pg/L， 峰ID号同表2) 图2倍他米松(左)和地塞米松(右)的结构式 图3倍他米松和地塞米松 MRM色谱图(10 ug/L) 图4布地奈德结构式(左：R型，右：S型) 图5布地奈德 MRM 色谱图 (10 pg/L) 3.2标准曲线 按1.2分析条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用外标法建立校准曲线(部分分合物的校准曲线见图6)，41种糖皮质激素在相应线性浓度范围内，相关系数在0.9956~0.9998之间，各浓度点的回读准确度在85.4%~110.2%之间，线性相关性良好。41种糖皮质激素中除氟氢缩松的仪器检出限(ASTM，S/N=3) 为 0.8 ug/L外，其他物质的仪器检出限均小于0.5 pg/L， 大大优于 GB/T 24800.2-2009 中的检测灵敏度，仪器测试的灵敏度高。其线性方程、相关系数及仪器检出限 (ASTM， S/N=3)见表3。 图63种糖皮质激素标准曲线 表341种糖皮质激素标准曲线参数(权重1/c2) 编号 化合物 线性方程 线性范围 (ug/L) 相关系数 r 准确度 (%) 仪器检出限 ug/L 1 曲安西龙 Y=(5243.21)X+(693.217) 0.5~200 0.9979 87.6~108.1 0.08 2 泼尼松龙 Y=(23719.8)X+(4124.32) 0.5~100 0.9982 90.4~105.2 0.09 3 泼尼松 Y=(40080.6)X+(6250.33) 0.5~20 0.9994 96.1~105.2 0.03 4 氢化可的松 Y=(23414.3)X+(4024.87) 0.5~100 0.9996 91.8~104.2 0.04 5 可的松 Y=(24064.6)X+(2585.17) 0.5~100 0.9998 93.8~104.9 0.06 6 甲基泼尼松龙 Y=(48408.2)X+(3297.23) 0.5~200 0.9994 93.9~104.1 0.06 7 倍他米松 Y=(10886.4)X+(-1595.10) 1.0~200 0.9990 94.5~107.4 0.05 8 氟米松 Y=(7335.72)X+ (405.233) 0.5~100 0.9990 93.3~105.0 0.05 9 地塞米松 Y=(8087.16)X+(980.987) 0.5~200 0.9994 95.2~104.3 0.07 10 倍氯米松 Y=(23890.8)X+(590.613) 1.0~200 0.9994 93.1~107.2 0.24 11 曲安奈德 Y=(8770.36)X+(817.347) 0.5~200 0.9978 94.6~106.8 0.10 12 氟氢缩松 Y=(984.777)X+(4940.00) 5.0~200 0.9992 93.9~106.8 0.80 13 曲安西龙双醋酸酯 Y=(7765.70)X+(6563.96) 1.0~100 0.9989 89.8~104.7 0.10 14 泼尼松龙醋酸酯 Y=(21202.8)X+(1256.79) 0.5~100 0.9988 91.0~104.5 0.04 15 氢化可的松醋酸酯 Y=(11964.0)X+(1817.89) 0.5~200 0.9976 89.7~106.5 0.02 16 氟米龙 Y=(19124.8)X+(1225.19) 0.5~200 0.9987 96.1~105.2 0.04 17 氟氢可的松醋酸酯 Y=(8319.30)X+(1507.14) 0.5~100 0.9950 85.4~110.2 0.05 18 泼尼松醋酸酯 Y=(29445.9)X+(2491.88) 0.5~100 0.9993 94.5~105.1 0.05 19 地夫可特 Y=(132891)X+(13479.7) 0.5~200 0.9994 95.8~105.5 0.01 20 可的松醋酸酯 Y=(21694.3)X+(2104.93) 0.5~50 0.9956 91.3~106.8 0.09 21 甲基泼尼松龙醋酸酯 Y=(28531.7)X+(-1689.45) 1.0~200 0.9990 92.1~104.7 0.21 22 倍他米松醋酸酯 Y=(1793.73)X+(-1241.22) 2.0~200 0.9968 92.6~108.6 0.70 23 布地奈德 Y=(41873.8)X+(1732.67) 0.5~100 0.9978 91.8~105.4 0.14 24 地塞米松醋酸酯 Y=(3136.75)X+(-887.234) 2.0~200 0.9996 91.2~105.7 0.35 25 氢化可的松丁酸酯 Y=(17698.7)X+(332.151) 0.5~100 0.9989 89.5~105.0 0.06 26 氟米龙醋酸酯 Y=(47927.0)X+(4668.99) 0.5~200 0.9990 90.4~105.4 0.02 27 氢化可的松戊酸酯 Y=(17377.3)X+(6189.27) 1.0~100 0.9965 93.2~105.9 0.13 28 曲安奈德醋酸酯 Y=(10103.5)X+(-580.298) 0.5~100 0.9976 92.7~106.5 0.06 29 氟轻松醋酸酯 Y=(8943.32)X+(1037.63) 1.0~100 0.9979 88.7~105.1 0.21 30 二氟拉松双醋酸酯 Y=(5832.54)X+(-1689.65) 1.0~100 0.9984 91.0~107.6 0.23 31 倍他米松戊酸酯 Y=(17490.7)X+(1714.54) 0.5~100 0.9992 93.7~104.4 0.06 32 哈西奈德 Y=(1850.19)X+(222.436) 5.0~200 0.9956 89.6~109.6 0.82 33 泼尼卡酯 Y=(20193.6)X+(-329.767) 0.5~100 0.9988 95.1~106.3 0.08 34 安西奈德 Y=(12542.1)X+(-1222.71) 1.0~200 0.9978 89.5~106.0 0.03 35 阿氯米松双丙酸酯 Y=(5514.60)X+(962.976) 0.5~200 0.9980 93.4~105.3 0.23 36 氯倍他索丙酸酯 Y=(6105.50)X+(1260.44) 2.0~200 0.9983 90.2~105.4 0.25 37 氟替卡松丙酸酯 Y=(9470.06)X+(-2918.90) 1.0~100 0.9966 92.1~107.2 0.12 38 莫米他松糠酸酯 Y=(7623.03)X+(880.306) 1.0~200 0.9988 91.9~104.9 0.30 39 倍他米松双丙酸酯 Y=(15143.1)X+(-47.5300) 0.5~100 0.9988 93.7~105.1 0.09 40 倍氯米松双丙酸酯 Y=(7276.46)X+(1742.12) 1.0~200 0.9985 92.5~104.1 0.15 41 氯倍他松丁酸酯 Y=(7566.69)X+(-247.068) 1.0~200 0.9987 90.9~104.2 0.11 3.3精密度 配制不同浓度的混合标准溶液依次进样，每个浓度平行测定6次，考察仪器的精密度。结果显示，41种糖皮质激素在各浓度下的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.02%~0.53%和0.42%~6.39%之间，结果表明仪器测试的精密度高(见表4)。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 编号 化合物名称 5.0 ug/L (RSD%) 10 ug/L (RSD%) 20 ug/L (RSD%) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 曲安西龙 0.43 1.69 0.34 2.24 0.09 1.23 2 泼尼松龙 0.52 2.00 0.42 2.39 0.09 1.97 3 泼尼松 0.51 1.04 0.40 1.63 0.08 1.10 4 氢化可的松 0.53 2.04 0.45 3.99 0.08 1.05 5 可的松 0.51 2.21 0.47 3.60 0.10 1.49 6 甲基泼尼松龙 0.48 1.25 0.42 1.38 0.11 0.67 倍他米松 0.47 1.55 0.43 2.94 0.10 2.70 8 氟米松 0.49 1.44 0.45 2.23 0.31 1.53 9 地塞米松 0.55 2.90 0.34 2.75 0.27 2.15 3.4基质加示实验 称取多份爽肤水样品各0.2g，分别添加41种糖皮质激素标准溶液，使各样品溶液(定容体积为10mL)的理论浓度分别为0(空白)、0.5 ug/g和 1.0 ug/g，按照2.2样品前处理方法处理样品，并按照1.2分析条件测试样品溶液，获得测试结果。其中空白爽肤水样品以及0.5 g/g爽肤水加标样品的色谱图如图7-8。每个基质加标溶液分别配制3份，计算41种糖皮质激素在各浓度下的平均加标回收率(其回收率见表5)。结果显示，不同基质加标浓度的回收率范围在 80.1%-113.6%之间，回收率结果良好。 图7空白样品 MRM 色谱图 图841种糖皮质激素 MRM色谱图(样品加标浓度为 0.5 ug/g) 表4.保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 编号 化合物名称 回收率(%) 回收率(%) 加标0.5(ug/g) 加标1.0(ug/g) 1 曲安西龙 80.9 82.1 泼尼松龙 80.1 83.7 3 泼尼松 87.5 88.9 4 氢化可的松 81.1 83.2 5 可的松 80.3 82.1 6 甲基泼尼松龙 80.2 86.9 7 倍他米松 89.9 91.8 8 氟米松 89.2 91.0 9 地塞米松 83.1 87.4 10 倍氯米松 89.0 92.3 11 曲安奈德 94.3 97.3 12 氟氢缩松 87.6 89.7 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 曲安西龙双醋酸酯 86.0 91.1 泼尼松龙醋酸酯 86.7 93.4 氢化可的松醋酸酯 95.2 99.2 氟米龙 89.7 93.6 氟氢可的松醋酸酯 98.1 104.2 泼尼松醋酸酯 80.7 88.4 地夫可特 89.8 94.9 可的松醋酸酯 81.9 86.3 甲基泼尼松龙醋酸酯 104.0 107.3 倍他米松醋酸酯 103.0 108.1 布地奈德 96.8 104.9 地塞米松醋酸酯 87.0 91.5 氢化可的松丁酸酯 88.2 95.4 氟米龙醋酸酯 88.5 91.9 氢化可的松戊酸酯 89.7 95.0 曲安奈德醋酸酯 84.3 87.5 氟轻松醋酸酯 106.3 108.9 二氟拉松双醋酸酯 97.0 104.4 倍他米松戊酸酯 105.1 107.8 哈西奈德 86.9 91.4 泼尼卡酯 101.8 106.1 安西奈德 94.3 98.5 阿氯米松双丙酸酯 105.7 111.3 氯倍他索丙酸酯 108.3 110.7 氟替卡松丙酸酯 105.4 108.9 莫米他松糠酸酯 104.9 109.6 倍他米松双丙酸酯 105.8 113.6 倍氯米松双丙酸酯 103.8 108.4 氯倍他松丁酸酯 82.6 87.4 |结论 本文使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8050 建立测定爽肤水中41种糖皮质激素的分析方法。该方法分析速度快，16分钟内完成所有41种糖皮质激素的测试，并实现了包括同分异构体化合物的液相分离。在灵敏度方面，41种糖皮质激素中除氟氢缩松的仪器检出限(S/N=3) 为0.8ug/L外，其他物质的仪器检出限均小于0.5 ug/L， 大大优于国家测试标准 (GB/T 24800.2-2009)。同时，在线性范围内，相关系数在0.9956~0.9998之间，线性关系良好。在精密度方面，41种糖皮质激素的保留时间相和峰面积的相对标准偏差分别在0.02%~0.53%和0.42%~6.39%之间，仪器精密度良好。在加标回收率上，41种糖皮质激素的不同基质加标浓度下的回收率范围在80.1%-113.6%之间，符合化妆品实际测试情况。该方法分析速度快，灵敏度高，可为化妆品质量监测等相关行业的从业人员参考使用。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文使用岛津三重四极杆液质联用仪LCMS-8050建立测定爽肤水中41种糖皮质激素的分析方法。该方法分析速度快，16分钟内完成所有41种糖皮质激素的测试，并实现了包括同分异构体化合物的液相分离。在灵敏度方面，41种糖皮质激素中除氟氢缩松的仪器检出限（S/N=3）为0.8 μg/L外，其他物质的仪器检出限均小于0.5 μg/L，大大优于国家测试标准GB/T 24800.2-2009。同时，在线性范围内，相关系数在0.9956~0.9998之间，线性关系良好。在精密度方面，41种糖皮质激素的保留时间相和峰面积的相对标准偏差分别在0.02%~0.53%和0.42%~6.39%之间，仪器精密度良好。在加标回收率上，41种糖皮质激素的不同基质加标浓度下的回收率范围在80.1%-113.6%之间，符合化妆品实际测试情况。该方法分析速度快，灵敏度高，可为化妆品质量监测等相关行业的从业人员参考使用。