祛痘类化妆品中36种抗感染类药物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-061Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-455 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 法测定化妆品中36种抗感染类药物的含量 LCMSMS-455 摘要：本文利用岛津 LCMS-8050 三重四极杆液质联用仪建立了 LC-MS/MS 测定36种抗感染类药物的方法。采用超快速正负极性切换进行扫描，一针16 min 内完成分析，使用基质提取液作为溶剂，在0.5~200 ng/mL浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好，相关系数r均大于0.996，重复进样 RSD 小于 7.82%。在0.5~2.5 mg/kg加标浓度下，36种抗感染类药物回收率分布在81.5%~110.4%之间。该方法适用于测定化妆品中36种抗感染类药物的含量。 关键词：三重四极杆液相色谱质谱联用仪化妆品 36种抗感染类药物 抗感染类药物如四环素类、喹诺酮类、磺胺类、林可酰胺类、硝基呋喃类等药物属于天然或人工合成的抗菌药物，具有抗菌和消炎的作用。目前我国将此类药物纳入处方药管理，严格控制其使用量。但是一些化妆品不法商家为追求经济利益，不顾消费者的健康安全，在祛痘类化妆品中违法添加这些药物。这样虽然在短期内可能起到除螨、、祛痘作用，但长期使用会刺激皮肤，引起接触性皮炎，严重时可导致对此类药物的耐药性，造成皮肤健康隐患。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)和欧盟化妆品规程 (Directive76/768/EEC)均明确规定此类物质为化妆品禁用成分。 此前，我国涉及化妆品中抗感染类药物检测的国家标准方法有：《化妆品安全技术规范》(2015年版)2.1氟康唑等9种组分、2.2盐酸美满霉素等7种组分、2.3 依诺沙星等10种组分等，各方法主要针对某一类物质进行测定。标准方法的相对分散性给检验工作带来了诸多不便；此外，近年来不法分子不断变换添加手段，转而添加标准外的成分来躲避监管；为此，2019年9月27日，国家药监局发布通告，将《化妆品中抗感染类药物的检测方法》纳入《化妆品安全技术规范 (2015年版)》中，规定了采用高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中36种抗感染类药物含量的方法。 本文采用岛津 LCMS-8050 三重四极杆液相色谱质谱联用仪，参照国家药监局2019年第66号通告中《化妆品中抗感染类药物的检测方法》，建立了化妆品中36种抗感染类药物的检测方法。该方法快速、准确、灵敏度高5，，可以用于市售化妆品中抗感染药物的筛查和准确测定。 表1 36种抗感染药物的化合物信息 序号 中文名称 类别 英文名称 CAS 分子式 分子量 1 甲硝唑 硝基咪唑类 Metronidazole 443-48-1 C，HgN303 171.2 2 林可霉素 林可酰胺类 Lincomycin 154-21-2 C18H34N20，S 406.5 3 磺胺吡啶 磺胺类 Sulfapyridine 144-83-2 CuHHNO，S 249.3 4 呋喃它酮 硝基呋喃类 Furaltadone 139-91-3 C13H16N40， 324.3 5 磺胺甲嘧啶 磺胺类 Sulfamerazine 127-79-7 CiH12N4O2S 264.3 6 依诺沙星 喹诺酮类 Enoxacin 74011-58-8 C15H1-FNO： 320.3 7 土霉素 四环素类 Oxytetracyclin 79-57-2 C22H24N20， 460.4 8 氟罗沙星 喹诺酮类 Fleroxacin 79660-72-3 C17H18F3N303 369.3 9 磺胺甲二唑 磺胺类 Sulfamethizole 144-82-1 C.HNO，S， 270.3 10 诺氟沙星 喹诺酮类 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN303 319.3 11 氧氟沙星 喹诺酮类 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN304 361.4 12 磺胺甲氧嗪 磺胺类 Sulfamethoxypyri- dazine 80-35-3 C11H12N4O3S 280.3 13 培氟沙星 喹诺酮类 Pefloxacin 70458-92-3 CHFNO： 333.4 14 四环素 四环素类 Tetracycline 60-54-8 C22H24N20： 444.4 15 多西环素 四环素类 Doxycycline 564-25-C C22H24N20： 444.4 16 环丙沙星 喹诺酮类 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN303 331.3 17 氟康唑 抗真菌类 Fluconazole 86386-73-4 C13H12F2N，0 306.3 18 恩诺沙星 喹诺酮类 Enrofloxacin 93106-60-6 C19HFNO： 359.4 19 米诺环素 四环素类 Minocycline 10118-90-8 C23H27N307 457.5 20 磺胺氯哒嗪 磺胺类 Sulfachloropyri- dazine 80-32-0 C10HgCINOS 284.7 21 沙拉沙星 喹诺酮类 Sarafloxacin 98105-99-8 C20H17F NO： 385.4 22 磺胺甲噁唑 磺胺类 Sulfamethoxazole 723-46-6 C10H1N30S 253.3 24 双氟沙星 喹诺酮类 Difloxacin 98106-17-3 C21H19F2N30： 399.4 24 金霉素 四环素类 Aureomycin 57-62-5 C22H23CIN20： 478.9 25 克林霉素磷酸酯 林可酰胺类 Clindamycin phos- 24729-96-2 C18H34CIN，O。PS 505.0 phate 26 莫西沙星 喹诺酮类 Moxifloxacin 151096-09-2 C21H24FN304 401.4 27 氯霉素 酰胺醇类 Chloramphenicol 56-75-7 CH2CN，0s 323.1 28 阿奇霉素 大环内酯类 Azithromycin 83905-01-5 C38H72N2012 749.0 29 克林霉素 大环内酯类 Clindamycin 18323-44-9 C18H33CIN20，S 425.0 30 酮康唑 抗真菌类 Ketoconazole 65277-42-1 C26H28CI2N404 531.4 31 克拉霉素 大环内酯类 Clarithromycin 81103-11-9 C38H69NO13 748.0 32 罗红霉素 大环内酯类 Roxithromycin 80214-83-1 C41H76N2015 837.1 33 联苯苄唑 抗真菌类 Bifonazole 60628-96-8 C22H18N2 310.4 34 灰黄霉素 抗真菌类 Griseofulvin 126-07-8 Ci7H17CIO， 352.8 35 克霉唑 抗真菌类 Clotrimazole 23593-75-1 C2H1CIN， 344.8 36 螺内酯 利尿剂 Spironolactone 52-01-7 C24H3204S 416.6 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为LC-30AD×2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20A 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪，LabSolutions LCMS Ver.5.93 版色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST 100 mm x2.1 mml.D.， 2 um 流动相：A相-5mmol/L乙酸铵缓冲溶液(pH4.0)；B相-乙腈(含0.1%甲酸) 流速：0.3mL/min 进样量： 2uL 柱温：40℃ 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表2 表2 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 3.0 Pumps Pump B Conc. 10 8.0 Pumps Pump B Conc. 23 10 Pumps Pump B Conc. 23 12 Pumps Pump B Conc. 90 13.5 Pumps Pump B Conc. 90 13.6 Pumps Pump B Conc. 10 16.0 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI， 正负离子同时扫描接口电压：4kV(+)；；-3kV(-)雾化气：氮气3.0L/min加热气：干燥空气10.0 L/minDL温度：250℃ 加热模块温度：400℃接口温度：300℃驻留时间：5ms干燥气：氮气10.0 L/minMRM参数：见表3 表3 MRM参数 序号 物质名称 电离方式 保留时间 (min) 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) Q1 Pre Q3 Pre (V) + 2.58 172.0 82.0* -15 甲硝唑 172.0 128.0 -11 -14 -14 2 4.50 407.2 359.4 -20 -20 -20 林可霉素 407.2 126.1* -20 -30 -20 250.0 156.0* -12 -17 3 磺胺吡啶 + 5.30 250.0 92.0 -12 -17 325.0 100.0 -12 -15 -17 4 呋喃它酮 + 5.50 325.0 281.0* -12 -20 265.0 156.0 -10 -17 5 磺胺甲嘧啶 + 5.89 265.0 92.0* -10 -29 -18 321.1 232.0 -16 -26 6 依诺沙星 + 7.65 321.1 303.1* -22 461.2 426.1* 土霉素 + 7.68 461.2 444.2 -17 370.2 269.1 -27 -19 8 氟罗沙星 十 7.95 370.2 326.0* -11 -20 -23 271.1 156.0* -10 -14 -17 9 磺胺甲二唑 + 7.95 271.1 92.0 -10 -27 -17 10 诺氟沙星 8.18 320.1 233.1 -16 -24 -17 320.1 276.1* -12 -18 -20 LCMSMS-455 30 + 13.50 531.2 244.0 -20 -34 -18 酮康唑 531.2 489.3* -20 -31 -18 748.6 158.1* -22 -28 -17 31 克拉霉素 + 13.56 748.6 590.6 -20 -20 -22 837.6 158.1* -20 -34 -17 32 罗红霉素 + 13.57 837.6 679.6 -20 -23 -26 311.2 243.1* -12 -16 -12 33 联苯苄唑 + 13.82 311.2 165.0 -12 -34 -18 353.2 165.0* -11 -21 -18 34 灰黄霉素 + 13.87 353.2 215.0 -10 -21 -15 + 277.1 165.1* -20 -30 -20 35 克霉唑 13.96 277.1 241.0 -10 -28 -17 341.1 107.0* -12 -29 -11 36 螺内酯 + 14.15 341.1 165.0 -17 -55 -17 注：*为定量离子。 1.3标准溶液的制备 标准储备液的配制：分别精精称取表1中各组分标准品约10 mg至10mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度(部分标准品需要加入少量甲酸或水促进溶解))，得到1.0 mg/mL的各标准储备液。 基质匹配标准曲线系列的配制：分别取适量各标准储备液于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶解，得到10ug/mL混合标准中间液；参考1.4前处理后的样品基质空白为溶剂，将混合标准中间液逐级稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 ng/mL的基质匹配标准工作曲线，待上机分析。 1.4样品前处理 准确称取化妆品样品0.2g， 置于15mL离心管中，准确加入3mL饱和氯化钠溶液，涡旋30s， 分散均匀，加入含0.5%甲酸的乙腈溶液5 mL，涡旋30s，超声提取30 min，涡旋混合摇匀，以8000 r/min 转速0℃冷冻离心5 min，吸取上清液于10mL容量瓶中，加水定容至10mL， 混匀，经0.22 um滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液备用。 结果与讨论 2.1标准品MRM色普图 按1.3配制的 50 ng/mL基质标准溶液，上机分析，得到36种抗感染类药物的 TIC图，见图1；同时图2还列出了部分通道的质量色谱图。 图136种抗感染类药物MRM图谱((50.0ng/mL，编号同表3) 1.49e6 Q353.20>165.00(+) 1.74e6 LCMSMS-455 Q370.20>326.00(+) 4.81e5Q281.10>156.00(+) 1.16e6 TIT 11.8 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 12.0 12.2 12.4 12.6 12.8 13.0 13.2 RT (min) RT (min) 图2部分化合物的质量色谱图(50.0 ng/mL) 2.2线性范围 按1.3配制基质匹配标准系列溶液，上机分析，得出各化合物线性范围和线性关系，如表4所示。使用流动相为溶剂配制低浓度标准溶液，以S/N=3作为仪器检出限，结果见表4。 表4 36种抗感染类药物线性关系及检出限 图3 部分化合物的线性图 2.3精密度考察 取10 ng/mL 基质标准溶液，注入液相色谱串联质谱仪，计算峰面积 RSD。结果显示各抗感染药物 RSD均小于7.82%，表明精密度满足试验需求。具体结果见表5。 表5精密度考察结果(n=6) No. 中文名 RSD(%) No. 中文名 RSD)((%) No. 中文名 RSD((%) 1 甲硝唑 3.51 13 环丙沙星 2.38 25 磺胺氯哒嗪 5.39 2 林可霉素 3.85 14 四环素 6.02 26 金霉素 3.58 3 磺胺吡啶 4.50 15 恩诺沙星 5.94 27 克林霉素 1.34 4 呋喃它酮 4.81 16 磺胺甲二唑 5.29 28 磺胺甲噁唑 5.26 5 依诺沙星 4.87 17 磺胺甲氧嗪 5.64 29 氯霉素 3.92 6 磺胺甲嘧啶 4.38 18 氟康唑 4.05 30 酮康唑 5.88 诺氟沙星 7.41 19 沙拉沙星 7.82 31 克拉霉素 2.31 8 土霉素 3.15 20 米诺环素 2.13 32 罗红霉素 4.42 9 氧氟沙星 3.47 21 双氟沙星 5.44 33 灰黄霉素 5.86 10 氟罗沙星 3.10 22 克林霉素磷酸酯 3.78 34 克霉唑 4.44 11 多西环素 4.24 23 莫西沙星 3.28 35 联苯苄唑 3.98 12 培氟沙星 6.98 24 阿奇霉素 5.62 36 螺内酯 7.13 2.4加标回收考察 采用上述方法测定市售某祛痘化妆品，未检出抗感染成分，且在出峰区域无明显干扰，色谱图见图4；在该样品中分别精密加入混合标准品，加标量分别为 0.5 mg/kg 和2.5 mg/kg， 各3份，按1.4项下方法进行样品处理和测定，使用基质标准曲线进行回收率的计算，各化合物平均回收率在 81.5%~110.4%之间。具体结果见表6. 图4 某化妆品提取液 MRM 色谱图 图5 36种抗感染类药物加标回收 MRM色谱图(加标浓度为2.5 mg/kg，编号见表3) 表6 回收率考察结果 编号 回收率，% 回收率，% 化合物 加标浓度 加标浓度 编号 化合物 加标浓度 加标浓度 (0.5mg/kg) (2.5mg/kg) (0.5mg/kg) (2.5mg/kg) 甲硝唑 96.3 98.3 19 沙拉沙星 99.9 99.2 2 林可霉素 90.3 99.1 20 米诺环素 101.8 107.5 3 磺胺吡啶 99.3 97.5 21 双氟沙星 97.2 98.5 呋喃它酮 91.5 99.6 22 克林霉素磷酸酯 90.9 91.9 5 依诺沙星 91.1 86.5 23 莫西沙星 93.6 88.9 6 磺胺甲嘧啶 99.9 99.3 24 阿奇霉素 87.5 91.5 7 诺氟沙星 95.4 104.3 25 磺胺氯哒嗪 89.4 89.1 8 土霉素 93.0 102.8 26 金霉素 89.8 83.5 9 氧氟沙星 94.3 92.3 27 克林霉素 101.5 101.0 10 氟罗沙星 94.6 95.1 28 磺胺甲噁唑 88.2 83.8 11 多西环素 88.7 92.2 29 氯霉素 110.4 97.9 12 培氟沙星 86.6 88.4 30 酮康唑 92.0 96.6 13 环丙沙星 99.9 100.0 31 克拉霉素 81.5 84.0 14 四环素 85.1 82.4 32 罗红霉素 87.9 89.2 15 恩诺沙星 88.7 85.7 33 灰黄霉素 82.8 84.4 16 磺胺甲二唑 94.8 93.4 34 克霉唑 86.9 91.0 17 磺胺甲氧嗪 97.3 95.8 35 联苯苄唑 85.9 90.4 18 氟康唑 98.9 99.0 36 螺内酯 91.6 99.6 结论 化妆品样品称样后，使用氯化钠溶液分散、含酸含酸溶液提取，离心、过滤后上虑测定，可在16 min 内快速、准确对其中的36种抗感染类药物进行筛查测定。本文考察了方法的线性、检出限、重复性、加标回收率；结果表明：36种抗感染类药物在检测范围内线性良好，相关系数均大于0.996；仪器最低检出浓度为 0.01~1 ng/mL，低于通告中《化妆品中抗感染类药物的检测方法》0.25 ug/g(换算相当于进样浓度5 ng/mL)的最低检测限要求；重复进样精密度在7.82%以内，回收率在81.5%~110.4%范围内。本方法快速、准确，可以满足国家药监局2019年第66号通告中《化妆品中抗感染类药物的检测方法》的要求。 岛津应用云 本文利用岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用仪建立了LC-MS/MS测定36种抗感染类药物的方法。采用超快速正负极性切换进行扫描，一针16 min内完成分析，使用基质提取液作为溶剂，在0.5~200 ng/mL浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好，相关系数r均大于0.996，重复进样RSD小于7.82%。在0.5~2.5 mg/kg加标浓度下，36种抗感染类药物回收率分布在81.5 %~110.4 %之间。该方法适用于测定化妆品中36种抗感染类药物的含量。