化妆品中对苯二胺等32种染发剂检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA22-197Excellence in Science Excellence in ScienceLC-304 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 双进样液相色谱仪测定化妆品中对苯二胺等32种染发剂含量 LC-304 摘要：本文使用岛津双进样液相色谱仪建立了快速测定对苯二胺等32种染发剂含量的方法。32种染发剂组分10-400m/L浓度范围内，其相关系数大于0.999，各浓度点的回读准确度在91.0%~113.6%之间，线性相关性良好。稳定性考察中，32种组分的保留时间相和峰面积的相对标准偏差分别在0.012~0.17%和0.039~2.88%之间，仪器精密度良好；并对实际样品进行分析。双进样液相色谱仪可以实现一次进样同时分析两组样品，分析快速，能满足国家药监局(2021年第17号)通告发布的《化妆品中对苯二胺等32种染发剂的检测方法》中液相方法的检测需求。 关键词：双进样液相色谱仪染发剂 对苯二胺 染发剂是给头发染色的一种化妆品，普遍含有对苯二胺类物质，这是染发剂中必须用到的一种着色剂。这类化合物是《化妆品安全技术规范(2015年版)》中规定准用组分，同时还有些物质如氢醌，是规定不允许添加的，属于染发剂的禁用物质。因此在染发剂等化妆品的相关管理中，需要有合适的检测方法来进行监控。 2021年3月2日，国家药监局发布通告 (2021实验部分 1.1仪器 本实验采用岛津双进样液相色谱仪，具体配置为： 输液泵：LC-40B XR、LC-40DXR (LPGE) 脱气机： DGU-405×2 自动进样器： SIL-40C XR 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.97 柱温箱：CTO-40C 图1双进样液相色谱仪 1.2系统介绍 1.2.1工作原理 该系统有两套独立的色谱流路，共用一个自动进样器；自动进样器有两个进样口，!，可以将同一瓶号样品(或不同瓶号样品)分别注入两条色谱流路中，然后同时触发两条色谱流路同时进行数据采集。流路图如下： 注：1.该系统具有两个独立液相流路，既可以同时使用，也可以单独使用。 2.该系统也可配置两个四元系统、两个二元系统或者四元系统+二元系统。 3.两个流路检测器可以配置紫外+PDA；也可配置 PDA+PDA 1.2.2软件设置 该系统只需使用一个 Labsolutions 软件即可进行两条流路的方法编辑以及数据采集。 1>两个流路的梯度程序设定 流路1是四元系统，运行第一组方法；流路2是二元系统，运行第二组方法，采集第二组样品 图3 双进样液相色谱的梯度设置界面 2>自动进样器的双进口与批处理表设置 分析 样品瓶号 样品瓶架 进样体积 样品瓶号(端口 样品瓶架进样体积 祥品名 样品ID 样品类型 方法文件 数据文件 20 5 G1 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.1cm (自动命名文件 20 5 G1 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.LCn (自动命名文件 119 5 G1+G2 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.lom (自动命名文件) 4 1710 5 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.Lcn 】(自动命名文件) 5 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3..Lcm (自动命名文件) 6 G1 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.Lon (自动命名文件) 119 5 G1+G2 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.Len 自动命名文件) 1-19 G1 +G2 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.LCIT 自动命名文件) 9 1 1 5 G1 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.1cm (自动命名文件 10 1 1 5 G1 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.1cm 【(自动命名文件 11 5 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.1cm (自动命名文件) 12 STD-250ppm 0：未知 SJ\染发剂项目\LC方法-3.1cm (自动命名文件) 图4 双进样液相色谱工作站中自动进样器与批处理的设置 1.2.3优势与特点 1>工作效率提升。在本案例中，根据标准规定32种染发剂的测定，需两针进样来完成两组化合物的测试，第一组55 min+第二组50 min， 两针供需105 min；采用该系统后，针针进样同时进行，总用时55 min；耗时降低一倍，可有效提升工作效率。 2>性价比提升。相比较传统需要两套独立 HPLC 进行两个独立方法运行的方式，双进样系统通过共用进样器、柱温箱、工作站等单元和部件，节省了仪器采购费用，提升性价比。 3>有效减少样品降解。染发剂样品易降解，标准规定样品处理后，需48小时内完成测试，分析时间的减半，有效减少样品降解。 因此，对易降解、分析时间长的样品分析，尤其是同一个检测项目需要两个方法两针进样的使用场景，该系统优势突出。 1.3分析条件 液相色谱条件1： (第一组(G1) 测定20种染发剂的色谱条件) 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (250 mm x4.6 mm l.D.， 5 um)， (P/N：227-30017-08，岛津((上海)实验器材有限公司) 流动相：A20mM磷酸二氢钾(pH7.5))B甲醇C乙腈 流速：1mL/min柱温：25℃进样体积：5uL 波长：280nm 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表1。 表1 第一组梯度洗脱时间程序 Time(min) A(%) B(%) C(%) 0 96 2 2 15 96 2 2 22 90 5 5 35 50 10 40 50 50 10 40 50.1 96 2 2 55 96 2 2 液相色谱条件2：(第二组(G2)测试12种染发剂的色谱条件) 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (250 mm x 4.6 mm l.D.， 5 um)， (P/N：227-30017-08，岛津(上海)实验器材有限公司) 流动相：A20mM磷酸二氢钾 B甲醇 流速：1mL/min 柱温：25℃ 进样体积：5uL 波 长 ： 2 8 0 n m 洗脱方式：梯度洗脱，时间程序见表2。 表2第二组梯度洗脱时间程序 Time(min) A(%) B(%) 0 92 8 8 92 8 35 50 50 45 50 50 45.1 92 8 55 92 8 1.4混合标准溶液配置 参照国家药品监督管理局2021年第17号通告的附件内容《化妆品中对苯二胺等32种组分检验方法》。 标准储备溶液：准确称取各染料对照品0.1g(精确到0.0001g)，分别置10mL容量瓶中，以2g/L亚硫酸氢钠水溶液和无水乙醇(1+1)的混合溶液溶解并定容至10mL，制成浓度约为 10 g/L 的各染料标准储备溶液。 标准工作溶液：取标准储备溶液适量于10 mL容量瓶中，使用无水乙醇稀释，配制成浓度为10、25、50、 100、250和400 mg/L 的标准工作溶液。现用现配。 1.5样品前处理方法 参照国家药品监督管理局2021年第17号通告的附件内容《化妆品中对苯二胺等32种组分检验方法》。 准确称取样品0.5g(精确到0.0001 g) 于10mL具塞比色管中，加无水乙醇/水 (1：1)的混合溶液至10 mL，涡旋1 min， 冰浴超声提取 15 min。如为浑浊溶液，，可取适量离心 (5000rpm) 5 min， 取上清液经0.45 pm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，并于48小时内完成检测。 结果与讨论 2.1标准溶液色谱图 混合标准溶液500ug/mL 的色谱图图5-6所示。 图5标准品溶液色谱图(400 ug/mL， 第一组) (21：2-氨基-3-羟基吡啶；1：p-苯二胺；2：p-氨基苯酚；25：2，6-二氨基吡啶；3：甲苯-2，5-二胺硫酸盐； 18：2，4-二氨基苯氧基乙醇 HCI； 4：m-氨基苯酚；20：4-氨基-m-甲酚；8：间苯二酚；6：2-氯-p-苯二胺硫酒盐； 22： N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐；12：2-甲基雷琐辛；9：2-硝基-p-苯二胺；14：苯基甲基吡唑啉酮；11：4-氨基-2-羟基甲苯；16：4-氨基-3-硝基苯酚28：4-氯雷琐辛；27：6-羟基吲哚；31：1，5-萘二酚；32：1-萘酚) 图66标准品溶液色谱图 (400 ug/mL，第二组) (17：m-苯二胺；19：氢醌；5：o-苯二胺；7：o-氨基苯酚；23：p-甲基氨基苯酚硫酸盐；24：4-硝基-o-苯二胺；10：甲苯-3，4-二胺； 13：6-氨基-m-甲酚；29：2，7-萘二酚；26： N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐； 15： N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺 HCI； 30：N-苯基-p-苯二胺) 2.2线性范围 将不同浓度的标准品溶液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用外标法建立校准曲线，部分化合物结果如图3所示。在10~400 mg/L 浓度范围内，具有较好的线性关系，线性相关系数> 0.999，具体结果见表1。 图7 部分化合物的校准曲线 表3 校准曲线参数 No. 化合物名称 校准曲线 相关系数r 准确度(%) 检出限(ug/kg) p-苯二胺 Y=(2286.21)X+(6257.97) 0.9998 97.1~103.3 23.2 p-氨基苯酚 Y=(3008.03)X+(-9180.41) 0.9992 91.2~111.4 19.8 3 甲苯-2，5-二胺硫酸盐 Y=(1464.55)X+(8844.79) 0.9998 93.5~104.7 30.4 4 m-氨基苯酚 Y=(5393.70)X+(-9234.72) 0.9996 93.8~107.0 12.6 5 o-苯二胺 Y=(5568.37)X+(-5105.54) 0.9999 98.6~103.1 4.4 6 2-氯 -p-苯二胺硫酸盐 Y=(1072.01)X+(5984.37) 0.9998 95.5~106.0 43 0-氨基苯酚 Y=(6858.88)X+(-7767.02) 0.9999 98.7~103.1 3.6 8 间苯二酚 Y=(3081.84)X+(-4109.06) 0.9993 91.0~109.4 26.4 9 2-硝基-p-苯二胺 Y=(9240.64)X+(-13747.0) 0.9990 93.0~108.3 7.6 10 甲苯-3，4-二胺 Y=(3842.33)X+(-4183.93) 0.9999 98.2~103.0 6.6 11 4-氨基-2-羟基甲苯 Y=(4493.80)X+(-1063.18) 0.9998 95.4~103.2 6.2 12 2-甲基雷琐辛 Y=(764.315)X+(-1047.33) 0.9996 94.6~107.3 85.8 13 6-氨基-m-甲酚 Y=(4537.99)X+(-4619.14) 0.9999 98.6~102.9 5.6 14 苯基甲基吡唑啉酮 Y=(5598.30)X+(-9670.34) 0.9998 94.7~105.2 11.4 15 N，N-二乙基甲苯-2，5-二胺 HCI Y=(2625.35)X+(-10114.5) 0.9995 93.2~111.4 15.8 16 4-氨基-3-硝基苯酚 Y=(8519.87)X+(-10445.9) 0.9996 93.4~107.4 3.4 17 m-苯二胺 Y=(3294.13)X+(-6766.67) 0.9998 97.2~105.8 7.6 18 2，4-二氨基苯氧基乙醇 HCI Y=(3004.17)X+(-12197.9) 0.9995 91.8~109.6 40.4 19 氢醌 Y=(5127.96)X+(-6359.88) 0.9999 98.5~103.3 4.8 20 4-氨基-m-甲酚 Y=(3012.78)X+(-4161.02) 0.9998 95.0~104.4 24.4 21 2-氨基-3-羟基吡啶 Y=(4067.63)X+(-17881.2) 0.9995 92.8~113.6 12.6 22 N，N-双(2-羟乙乙基)-p-苯二胺硫酸盐 Y=(1791.25)X+(-3055.88) 0.9998 94.5~103.9 43.2 23 p-甲基氨基苯酚硫酸盐 Y=(1513.74)X+(1315.50) 0.9997 92.3~104.9 12.4 24 4-硝基-0-苯二胺 Y=(9171.01)X+(-6435.17) 0.9999 98.9~102.1 2.6 25 2，6-二氨基吡啶 Y=(5649.45)X+(-14363.1) 0.9995 92.7~108.8 10.2 26 N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 Y=(1923.78)X+(-3246.33) 0.9999 98.5~104.5 15.8 27 6-羟基吲哚 Y=(6735.51)X+(-4262.91) 0.9997 94.5~105.5 3.4 28 4-氯雷琐辛 Y=(4426.69)X+(-5052.74) 0.9996 93.7~107.1 5.6 29 2，7-萘二酚 Y=(5992.52)X+(-1310.92) 0.9999 99.3~100.7 3.4 30 N-苯基-p-苯二胺 Y=(21936.2)X+(-15984.6) 0.9999 99.3~102.0 1.4 31 1.5-萘二酚 Y=(7911.10)X+(-8755.74) 0.9996 94.0~106.8 3.2 32 1-萘酚 Y=(7170.95)X+(-10225.3) 0.9995 93.7~107.5 6.4 2.3精密度实验 不同浓度的标准品溶液连续进样6次，用于考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.012~0.42%和0.039~3.99%之间，仪器精密度良好。 表4 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) No. 名称 RSD% (10 mg/L) RSD% (50mg/L) RSD% (250mg/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 p-苯二安 0.019 0.132 0.054 0.130 0.076 0.227 2 p-氨基苯酚 0.065 0.318 0.025 0.119 0.072 0.189 3 甲苯-2，5-二胺硫酸盐 0.088 1.194 0.049 0.326 0.067 0.231 4 m-氨基苯酚 0.074 0.757 0.024 0.669 0.039 0.653 5 o-苯二胺 0.106 0.904 0.153 0.319 0.151 0.415 6 2-氯-p-苯二胺硫酸盐 0.091 0.471 0.026 0.379 0.052 0.284 7 o-氨基苯酚 0.087 0.588 0.137 0.314 0.155 0.510 8 间苯二酚 0.087 0.615 0.032 0.370 0.043 0.241 9 2-硝基-p-苯二胺 0.050 0.295 0.017 0.066 0.037 0.223 10 甲苯-3，4-二胺 0.044 1.405 0.053 0.284 0.025 0.309 11 4-氨基-2-羟基甲苯 0.012 0.298 0.009 0.166 0.023 0.637 12 2-甲基雷琐辛 0.060 1.008 0.020 0.514 0.036 0.226 13 6-氨基-m-甲酚 0.045 1.307 0.038 0.206 0.020 0.355 14 苯基甲基吡唑啉酮 0.024 1.077 0.020 0.261 0.021 0.262 15 N，N- 二乙基甲苯-2，5-二胺 HCI 0.167 2.879 0.021 0.774 0.056 0.362 16 4-氨基-3-硝基苯酚 0.011 0.039 0.008 0.100 0.022 0.394 17 m-苯二胺 0.326 0.894 0.422 0.154 0.367 0.300 18 2，4-二氨基苯氧基乙醇 HCI 0.118 2.329 0.057 1.274 0.104 3.994 19 氢醌 0.172 0.753 0.162 0.308 0.178 0.439 20 4-氨基-m-甲酚 0.136 0.473 0.032 0.101 0.061 0.318 21 2-氨基-3-羟基吡啶 0.052 0.596 0.072 0.405 0.068 0.488 22 N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐 0.089 1.119 0.024 0.338 0.060 0.826 23 p-甲基氨基苯酚硫酸盐 0.080 2.254 0.116 0.684 0.134 0.395 24 4-肖基-0-苯二胺 0.046 0.702 0.067 0.262 0.044 0.297 25 2，6-二氨基吡啶 0.065 0.137 0.033 0.073 0.053 0.347 26 N，N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐 0.154 2.031 0.019 0.685 0.029 0.296 27 6-羟基吲哚 0.012 0.064 0.008 0.070 0.022 0.168 28 4-氯雷琐辛 0.013 0.123 0.011 0.117 0.021 0.291 29 2，7-萘二酚 0.030 0.817 0.018 0.283 0.029 0.284 30 N-苯基-p-苯二胺 0.035 0.935 0.024 0.369 0.081 0.309 31 1，5-萘二酚 0.013 0.032 0.009 0.088 0.022 0.307 32 1-萘酚 0.019 0.132 0.012 0.228 0.024 0.187 2.4样品测试 取5个染发剂样品，分别准确称量0.5 g， 参考1.4的样品前处理方法，制备上机。具体测试结果如下表5。其样品色谱图如图8. mAU -Ch1 280nm，4nm 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 图8样品色谱图 表5 样品测试结果 No. 化合物 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 1 p-苯二胺 0.72% 0.60% 2 p-氨基苯酚 0.43% 0.35% 3 甲苯-2，5-二胺硫酸盐 0.12% 0.49% 4 m-氨基苯酚 0.03% 0.02% 0.22% 0.16% 8 间苯二酚 0.07% 0.14% 0.34% 11 4-氨基-2-羟基甲苯 0.17% 22 N，N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐 0.75% 28 4-氯雷琐辛 0.09% 32 1-萘酚 0.54% 结论 本文使用岛津双进样液相色谱仪建立快速测定对苯二胺等32种染发剂含量的方法，并考察了线性、重复性、实际样品测试等，可以满足国家药监局(2021年第17号)通告发布的《化妆品中对苯二胺等32种染发剂的检测方法》的检测需求。双进样液相色谱仪可以实现一次进样同时分析两组样品，分析耗时降低一倍，「防止样品降解的可能，可供相关行业参考。 岛津应用云 本文使用岛津双进样液相色谱仪建立快速测定对苯二胺等32种染发剂含量的方法，并考察了线性、重复性、实际样品测试等，可以满足国家药监局（2021年 第17号）通告发布的《化妆品中对苯二胺等32种染发剂的检测方法》的检测需求。双进样液相色谱仪可以实现一次进样同时分析两组样品，分析耗时降低一倍，防止样品降解的可能，可供相关行业参考。