枸杞子中展青霉素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-289Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-500 Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定中药材枸杞子中展青霉素 LCMSMS-500 摘要：本文依据2020版《中国药典》通则2351真菌毒素测定法中的展青霉素测定法，采用岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用仪建立了 LC-MS/MS 法测定枸杞子中展青霉素。在10.0~500.0 ng/mL 浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好，相关系数r大于0.999，定量限可达2.1 ng/mL。精密度实验中，保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.70%-0.79%和0.1.52%-2.14%之间，系统精密度良好。 关键词：三重四极杆液相色谱质谱联用仪中药材展青霉素 中药材从种植、生产、流通的全过程周期较长，控制不当易受真菌毒素危害，再加上真菌毒素的产生与宿主基质特性密切相关，不同类型中药材会产生种类和性质各异的真菌毒素；酸性果实类中药应注意展青霉素的检测，如构杞子、乌梅、酸枣仁等。2020版《中国药典》通则2351中增订了展青霉素测定法。展青霉素测定法项下有且仅有一种检测方法，即液相色 谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。 本文采用岛津LCMS-8050三重四极杆液相色谱质谱联用仪，参照《2351真菌毒素测定法》中的展青霉素测定法内容项下的仪器参数、色谱条件、推荐离子对及样品前处理方式，建立了中药材中展青霉素LC-MS/MS测定法。该方法灵敏度高、重复性好，可用于中药材中展青霉素的检测。 1.1仪器 本实验采用岛津 LCMS-8050超高效液相色谱三重四极杆质谱联用系统，具体配置为： 系统控制器： CBM-20A脱气机：DGU-20Ase输液泵：LC-30AD×2自动进样器： SIL-30AC柱温箱： CTO-20AC质谱仪： LCMS-8050 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (2.1 mml.D.×50 mm L.， 2.0um， 岛津(上海)实验器材有限公司， PN： 227-30001-02) 流动相：A相-水，B相-乙腈 流速：0.3mL/min 进样体积：5uL 柱温：25℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为3%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 4.00 泵 B. Conc 3 4.20 泵 B. Conc 40 9.00 泵 B. Conc 40 9.50 泵 B. Conc 3 15.00 控制器 Stop 质谱条件 质谱仪：LCMS-8050 脱溶剂管温度：250℃ 离子源： ESI(-) 雾化气：氮气3L/min 干燥气：氮气10 L/min 加热模块温度：400℃接口温度：300℃扫描模式：MRM 加热气：空气10L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM参数 中文名 英文名(缩写) 监测离子对 Q1 Pre(V) CE Q3 Pre(V) 展青霉素 Patulin (PAT) 153.0>81.0* 17 13 26 153.0>109.0 17 12 11 注：*表示定量离子 1.3对照品溶液的制备 精密称取展青霉素对照品适量，加乙腈制成每1mL含0.1mg的溶液，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液，用2%乙腈(用乙酸调节pH 值至2)稀释成浓度为10~500 ng/mL 的系列对照品溶液，即得。 1.4供试品溶液的配制 取供试品粉末约4g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加水20mL和果胶酶(活性大于1500IU/g)75uL，混匀，40℃下放置2小时，精密加入乙腈60mL，高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000转/分钟)，离心10分钟(离心速度4000转/分钟)，取上清液20mL，加入无水硫酸镁：无水醋酸钠(质量比4：1)混合粉末3g，充分振摇2分钟，离心10分钟(离心速度4000转/分钟)，取上清液8mL，通过展青霉素固相净化柱 (SHIMSEN真菌毒素净化柱，岛津((上海)实验器材有限公司，PN： 380-00902)，收集净化液，混匀，精密量取5mL(相当于0.3g样品)，置玻璃试管中，40℃条件下用氮气吹至近干，加2%乙腈溶液(用乙酸调节 pH值至2)定容至0.5mL， 涡旋2分钟使混匀，用微孔滤膜(0.22um)滤过，取续滤液，即得。 1.5基质对照品溶液的制备 取空白基质样品4g，一式多份，同供试品溶液的制备方法处理至“40℃条件下用氮气吹至近干”，分别精密加入上述系列对照品溶液 0.5 mL， 涡旋混匀，用微孔滤膜滤过(0.22um)滤过，取续滤液，即得。 1.6测定法 精密吸取上述系列对照品溶液各5uL，注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液5uL， 注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于展青霉素的浓度，计算，即得。 结果与结论 2.1枸杞子基质对照品溶液色谱图 图1枸杞子基质对照品溶液 MRM 色谱图(10.0ng/mL) 2.2标准曲线 将10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng/mL系列枸杞子基质对照品溶液进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表3。枸杞子基质中展青霉素线性相关性良好，相关系数r值大于0.999，准确度在94.6%~104.0%之间。 图2展青霉素标准曲线 表3 标准曲线结果 中文名称 线性范围 (ng/mL) 标准曲线 相关系数(r) 准确度(%) 定量限(ng/mL) 展青霉素 10.0-500.0 Y=(7775.77)X+(5213.54) 0.9995 94.6-104.0 2.1 2.3精密度考察 取枸杞子基质对照品溶液 10.0 ng/mL 及 50.0 ng/mL， 注入液相色谱串联质谱仪，连续分析6次，计算目标化合物的保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD%)，具体结果见表4。目标化合物的保留时间和峰面积的相对准偏差在0.70%-0.79%和0.1.52%-2.14%之间，仪器精密度良好。 表4精密度考察结果(n=6) 名称 RSD% (10 ng/mL) RSD% (50ng/mL) R.T. Area R.T. Area 展青霉素 0.70 2.14 0.79 1.52 2.4实际样品测定 取市售枸杞子药材，按1.4供试品溶液的制备进行样品前处理，按照1.2分析条件进样分析，采用外标校准曲线法定量。结果显示该枸杞子中未检测到展青霉素。 Q153.00>81.00 (-) 2.64e3 图3 枸杞子供试品 MRM 色图谱 结论 本文参照2020版《中国药典》通则2351项下展青霉素测定法，利用 LCMS-8050三重四极杆液质联用仪建立了中药材中展青霉素的 LC-MS/MS 测定法。该方法在10.0~500.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数r大于0.999，定量限可达2.1 ng/mL。精密度实验中，保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.70%-0.79%和0.1.52%-2.14%之间，仪器精密度良好。使用岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用仪测定中药材中展青霉素，结果表明具有灵敏度高，重复性好等优势。该系统适用于中药材中展青霉素的测定。 岛津应用云 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心 中药材从种植、生产、流通的全过程周期较长，控制不当易受真菌毒素危害，再加上真菌毒素的产生与宿主基质特性密切相关，不同类型中药材会产生种类和性质各异的真菌毒素；酸性果实类中药应注意展青霉素的检测，如枸杞子、乌梅、酸枣仁等。2020版《中国药典》通则2351中增订了展青霉素测定法。展青霉素测定法项下有且仅有一种检测方法，即液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）。本文采用岛津LCMS-8050三重四极杆液相色谱质谱联用仪，参照《2351真菌毒素测定法》中的展青霉素测定法内容项下的仪器参数、色谱条件、推荐离子对及样品前处理方式，建立了中药材中展青霉素LC-MS/MS测定法。该方法灵敏度高、重复性好，可用于中药材中展青霉素的检测。