薏苡仁中10种真菌毒素检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-282Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-497 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 测定中药材苡苡仁中10种真菌毒素 LCMSMS-497 摘要：本文采用岛津 LCMS-8050 三重四极杆液质联用仪建立了 LC-MS/MS 法测定2020版 《中国药典》通则2351中的多种真菌毒素测定法规定的10种真菌毒素。在0.2~4.0 ng/mL(以黄曲霉毒素B1计)浓度范围内建立外标基质标准曲线，线性关系良好，相关系数r均大于0.995，准确度在93.4%~108.9%之间。精密度实验中，10种真菌毒素的保留时间和峰面积重复性的相对标准偏差在0.02%-0.09%和2.23%-4.81%之间。回收率实验考察，10种真菌毒素的平均回收率在61.3-97.4%之间。本方法适用于中药材中多种真菌毒素的筛查测定。 关键词：三重四极杆液相色谱质谱联用仪中药材薏苡仁多种真菌毒素 中药材从种植、生产、流通的全过程周期较长，控制不当易受真菌毒素危害，再加上真菌毒素的产生与宿主基质特性密切相关，不同类型中药材会产生种类和性质各异的真菌毒素，全方位加强中药材中真菌毒素污染水平监控成为《中国药典》2020版的重中之重。 2020年版《中国药典》增订了4种真菌毒素素(赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、展青霉素)和多种真菌毒素测定法；蜂房、九香虫、马钱子、土鳖虫等药材在正文品种项下增订了黄曲霉毒素检测项 目，薏苡仁增加了玉米赤霉烯酮的限量要求。品种的增加说明对药品质量标准的要求越来越高，对中药材进行真菌毒素的高效便捷检测尤为必要。 本文采用岛津 LCMS-8050 三重四极杆液相色谱质谱联用仪，依照2020版《中国药典》通则2351中的多种真菌毒素测定法的仪器参数、色谱条件及10种真菌毒素推荐离子对及样品前处理方法，建立一针进样同时测定中药材中10种真菌毒素的LC-MS/MS 方法。该方法灵敏度高，重复性好，可用于中药材中多种真菌毒素的快速筛查。 1.1仪器 本实验采用岛津 LCMS-8050超高效液相色谱三重四极杆质谱联用系统，具体配置为： 系统控制器： CBM-20A 脱气机： DGU-20A5R 输液泵： LC-30AD×2 自动进样器：SIL-30AC 柱温箱： CTO-20AC 质谱仪： LCMS-8050 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.98 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS-HP C18 [Metal free column](2.1 mm 1.D.×100 mm L.， 1.9 um，岛津(上海)实验器材有限公司， PN： 227-30922-02) 流动相：A相-0.01%甲酸水溶液，B相-乙腈-甲醇溶液(1：1， v/v) 流速：0.3mL/min 进样体积：5uL 柱温：50℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 2.00 泵 B. Conc 5 2.10 泵 B. Conc 40 7.00 泵 B. Conc 55 10.00 泵 B. Conc 90 10.50 泵 B. Conc 5 16.00 控制器 Stop 质谱条件 质谱仪：LCMS-8050脱溶剂管温度：150℃离子源： ESI (+/-)加热模块温度：500℃雾化气：氮气2.5 L/min接口温度：400C干燥气：氮气3.0L/min扫描模式：MRM加热气：空气3.0 L/minMRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 No. 中文名 英文名(缩写) 保留时间 (min) 监测离子对 Q1 Pre(V) CE Q3 Pre (V) 313.0>241.0 -22 -40 -24 1 黄曲霉毒素B1 Aflatoxin B1 (AFB1) 5.51 313.0>285.1 -22 -25 -19 315.0>259.0 -22 -30 -27 2 黄曲霉毒素B2 Aflatoxin B2 (AFB2) 5.22 315.0>287.1 -22 -27 -19 329.0>243.1 -22 -29 -25 3 黄曲霉毒素G1 Aflatoxin G1 (AFG1) 5.04 329.0>311.0 -22 -22 -30 331.0>245.1 -22 -31 -25 4 黄曲霉毒素 G2 Aflatoxin G2 (AFG2) 4.79 331.0>313.1 -22 -26 -20 5 伏马毒素B1 Fumonisin B1(FB1) 6.48 722.3>352.3 -26 -37 -24 722.3>334.3 -26 -41 -22 6 伏马毒素 B2 Fumonisin B2(FB2) 8.74 706.3>336.3 -26 -39 -23 706.3>318.3 -26 -41 -22 7 T-2毒素 T-2 toxin(T-2) 7.92 489.1>387.1 -18 -24 -18 489.1>245.1 -18 -30 -25 8 呕吐毒素 Deoxynivale- 3.69 297.0>249.1 -21 -12 -17 nol(DON) 297.0>231.1 -21 -15 -23 402.0>211.0 12 28 14 9 赭曲霉毒素A Ochratoxin A(OTA) 8.83 402.0>358.1 12 21 13 10 玉米赤霉烯酮 Zearalenone(ZEN) 8.70 317.1>175.1 16 24 12 317.1>131.0 16 30 26 注：表格中多对监测离子对供定量和定性分析选择使用。 1.3对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素 G2、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素B1、伏马毒素 B2 及T-2毒素对照品溶液量量，加50%乙腈溶液制成下表所述浓度的混标贮备溶液；再用50%乙腈溶液稀释成下表所述浓度的系列混合对照品溶液。 表3 混合对照品溶液浓度表 单位 (ng/ml) 混标贮备溶液 系列混合对照品溶液 1 2 3 4 5 黄曲霉毒素B1 50.0 0.2 0.4 1.0 2.0 4.0 黄曲霉毒素B2 25.0 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 黄曲霉毒素 G1 50.0 0.2 0.4 1.0 2.0 4.0 黄曲霉毒素 G2 25.0 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 伏马毒素B1 500.0 2.0 4.0 10.0 20.0 40.0 伏马毒素B2 500.0 2.0 4.0 10.0 20.0 40.0 T-2毒素 500.0 2.0 4.0 10.0 20.0 40.0 呕吐毒素 12500.0 50.0 100.0 250.0 500.0 1000.0 赭曲霉毒素A 50.0 0.2 0.4 1.0 2.0 4.0 玉米赤霉烯酮 125.0 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 1.4供试品溶液的配制 取供试品粉末约5g(过二号筛)，精密称定，精密加入70%甲醇溶液 50 mL， 超声处理30分钟，离心，精密量取上清液10mL， 用水稀释至20mL，摇匀。精密量取3mL，缓慢通过已经处理好的 HLB柱[规格：3mL(60mg)，依次用甲醇和水各3mL洗脱] (SHIMSEN Styra HLB 60mg/3mL，岛津(上海)实验器材有限公司，，FPN： 380-00855-03)，直至有适量空气通过，收集洗脱液；随后用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，合并两次洗脱液i，，于40℃氮气缓慢吹至近干，加50%乙腈溶液定容至1mL，用微孔滤膜 (0.22um) 滤过，取续滤液，即得。 1.5基质混合对照品溶液的制备 取空白基质样品5 g，同供试品溶液的制备方法处理至“40℃条件下用氮气吹至近干”，分别精密加入上述系列对照品溶液1.0mL，涡旋混匀，用微孔滤膜滤过(0.22um)滤过，取续滤液，即得。 1.6测定法 分别精密吸取上述系列基质混合对照品溶液各5uL， 注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液5uL，注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、伏马毒素 B2及T-2毒素的浓度，计算，即得。 结果与讨论 2.1薏苡仁基质混合对照品溶液色谱图 图110种真菌毒素薏苡仁基质混合对照品溶液的 MRM色谱图((以黄曲霉毒素B1计浓度为 0.2 ng/mL) 2.2标准曲线 将0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 ng/mL系列薏苡仁基质混合对照品溶液(以黄曲霉毒素B1计)进样分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制校准曲线，结果见表4。薏苡仁基质中10种真菌毒素线性相关性良好，r均大于0.995，准确度在93.4%~108.9%之间。 表4 标准曲线结果 No. 中文名称 线性范围 (ng/mL) 标准曲线 相关系数(r) 准确度(%) 定量限(ng/mL) 1 黄曲霉毒素B1 0.2-4.0 Y=(208888)X+(2734.77) 0.9989 96.3-104.8 0.02 2 黄曲霉毒素B2 0.1-2.0 Y=(179612)X+(-423.753) 0.9984 96.6-107.1 0.02 3 黄曲霉毒素 G1 0.2-4.0 Y=(151059)X+(1254.93) 0.9999 98.4-100.9 0.05 4 黄曲霉毒素 G2 0.1-2.0 Y=(59929.1)X+(-163.131) 0.9990 94.6-103.5 0.05 5 伏马毒素B1 2.0-40.0 Y=(34742.4)X+(13141.8) 0.9997 97.2-102.3 0.10 6 伏马毒素B2 2.0-40.0 Y=(58100.7)X+(9768.76) 0.9998 98.5-102.7 0.10 7 T-2毒素 2.0-40.0 Y=(129557)X+(-3247.95) 0.9995 97.5-103.9 0.18 8 呕吐毒素 50.0-1000.0 Y=(487.223)X+(-864.673) 0.9997 98.1-103.1 5.65 9 赭曲霉毒素A 0.2-4.0 Y=(27624.9)X+(-53.1886) 0.9975 95.8-108.9 0.05 10 玉米赤霉烯酮 0.5-10.0 Y=(60428.0)X+(126715) 0.9974 93.4-108.2 0.05 2.3精密度考察 取薏苡仁基质混合对照品溶液 0.2 ng/mL (以黄曲霉毒素B1计)，注入液相色谱串关质谱仪，连续分析6次，计算目标化合物的保留时间和峰面积相对标准偏差 (RSD%)，，具体结果见表5。目标化合物的保留时间和峰面积的相对准偏差在0.02%-0.09%和2.23%-4.81%之间，结果表明该仪器具有良好精密度。 表5 精密度考察结果 (n=6) No. 中文名 浓度(ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD(%) 黄曲霉毒素B1 0.2 0.05 3.35 2 黄曲霉毒素B2 0.1 0.06 3.31 3 黄曲霉毒素 G1 0.2 0.07 3.42 4 黄曲霉毒素 G2 0.1 0.09 4.55 5 伏马毒素B1 2.0 0.04 3.51 6 伏马毒素B2 2.0 0.04 2.23 7 T-2毒素 2.0 0.03 3.18 8 呕吐毒素 50.0 0.02 4.21 9 赭曲霉毒素A 0.2 0.03 4.81 10 玉米赤霉烯酮 0.5 0.03 3.35 2.4回收率考察 取薏苡仁供试品，按低、中、高三水平水行加标，分别精密加入1.3项下的混标贮备溶液40，100，200uL，各水平平行制备3份，按1.4项下供试品容液的配制进行样品前处理，回收率测定结果见表6。结果表明，10种真菌毒素平均平收率在 61.3-97.4%之间。 表5 精密度考察结果((n=6) No. 中文名 平均回收率(%) 低 中 高 黄曲霉毒素B1 80.2 83.8 75.3 2 黄曲霉毒素B2 79.7 82.8 79.0 3 黄曲霉毒素G1 80.9 84.1 72.6 4 黄曲霉毒素 G2 74.1 85.0 75.8 5 伏马毒素B1 67.9 79.3 77.8 6 伏马毒素B2 61.3 72.9 71.3 7 T-2毒素 87.1 94.0 90.3 8 呕吐毒素 89.1 97.4 95.9 9 赭曲霉毒素A 69.4 70.0 66.0 10 玉米赤霉烯酮 61.9 86.2 77.8 2.5实际样品测定 取市售薏苡仁药材，按1.4供试品溶液的制备进行样品前处理，按照1.2分析条件进样分析。采用外标校准曲线法定量，定量结果如下表。按照薏苡仁品种项下真菌毒素限量要求，样品符合要求。 表7 薏苡仁供试品测定结果 No. 化合物 检出量(ug/kg) 限量 ((ug/kg) 1 黄曲霉毒素B1 N.D. 2 黄曲霉毒素 B2 N.D. AFB1≤5， 3 黄曲霉毒素 G1 N.D. Total≤ 10 4 黄曲霉毒素 G2 N.D. 5 伏马毒素B1 96.4 6 伏马毒素B2 14.4 7 T-2毒素 N.D. 8 呕吐毒素 133.7 9 赭曲霉毒素A N.D. 一 10 玉米赤霉烯酮 326.6 500 N.D.=Not Detected 结论 本文参照2020版《中国药典》通则2351中的《多种真菌毒素测定法》，利用LCMS-8050 三重四极杆液质联用仪建立了10种真菌毒素的 LC-MS/MS 快速筛查方法。该方法在0.2~4.0 ng/mL (以黄曲霉毒素B1计)浓度范围内线性关系良好，相关系数r 均大于 0.995。精密度实验中，10种真菌毒素的保留时间和峰面积重复性的相对标准偏差在0.02%-0.09%和2.23%-4.81%之间，仪器精密度良好。加标回收率考察结果显示，10种真菌毒素的平均回收率在61.3-97.4%之间，该方法的回收率结果良好。该方法灵敏度高，重复性好，可用于中药材中多种真菌毒素的筛查测定。 岛津应用云 中药材从种植、生产、流通的全过程周期较长，控制不当易受真菌毒素危害，再加上真菌毒素的产生与宿主基质特性密切相关，不同类型中药材会产生种类和性质各异的真菌毒素，全方位加强中药材中真菌毒素污染水平监控成为《中国药典》2020版的重中之重。2020年版《中国药典》增订了4 种真菌毒素（赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、展青霉素）和多种真菌毒素测定法；蜂房、九香虫、马钱子、土鳖虫等药材在正文品种项下增订了黄曲霉毒素检测项目，薏苡仁增加了玉米赤霉烯酮的限量要求。品种的增加说明对药品质量标准的要求越来越高，对中药材进行真菌毒素的高效便捷检测尤为必要。本文采用岛津LCMS-8050三重四极杆液相色谱质谱联用仪，依照2020版 《中国药典》通则2351中的多种真菌毒素测定法的仪器参数、色谱条件及10种真菌毒素推荐离子对及样品前处理方法，建立一针进样同时测定中药材中10种真菌毒素的LC-MS/MS方法。该方法灵敏度高，重复性好，可用于中药材中多种真菌毒素的快速筛查。