毛发中羧基-THC检测方案(液质联用仪)

Agilent 6470A 使用 Agilent Captiva EMR-Lipid净化产品对毛发中的羧基-THC进行LC/MS/MS 测定 Maria Del Bianco LuppiJM BioAnalises 本应用简报比较了两种 LC/MS/MS 型号，即 Agilent 6470A 三重四极杆液质联用系统和 Agilent 6495C 三重四极杆液质联用系统。本研究总结了可用于复杂毛发基质的样品前处理技术。同时还介绍了使用 Agilent Captiva EMR-Lipid 执行净化步骤时选择用于验证的最终方法，以达到毛发中羧基-THC 0.2 ng/g 的临界浓度。 巴西圣保罗州巴鲁埃里 前言 通过毛发测试滥用药物已有50多年的历史。与生物体液相比，毛发测试的一个优势在于它可提供更大的药物检测窗口期。许多药物在毛发中保存完好。一个示例是在一具距今900年的木乃伊的毛发中检出了可卡因。毛发测试的应用包括刑事调查，核实吸毒史，鉴定药物辅助性侵犯，在儿童监护权案件中证明毒品的使用，假释犯、药物治疗参与者或员工的戒断监测，记录宫内暴露情况，以及确定某人是否经常吸食大麻从而确定能否重新申领驾照。图1显示了大麻素进入人体毛发的可能途径。 由于毛发易于收集、很难掺假且具有较长的检测期限，因此工作场所检测计划包括毛发检测。许多国家/地区均发布了工作场所毛发检测指南。指南确定大麻代谢物/mg毛发的初始测试临界浓度为 1 pg。在巴西，该限值由国际毛发分析协会(SoHT)规定，每毫克毛发中11-nor-9-羧基-△-四氢大麻酚 (THC-COOH) 的确认性临界浓度为 0.0002 ng。使用足够灵敏的特定分析流程对毛发中的药物进行检测和定量非常重要，这同时也是工作流程中的瓶颈。这对毛发中的低浓度大麻素尤其重要。免疫分析测试已得到广泛应用，但在灵敏度、选择性和成本方面仍然存在挑战。 色谱测定具有更高的特异性，可选择作为毛发中大麻素的确定方法，提供良好的检测限(LOD)和定量限。灵敏的免疫分析和气相色谱测定具有更高的特异性，是确定毛发中大麻素的不错选择，可提供较低的 LOD 和定量限(LOQ)。使用灵敏的免疫分析、电子电离(EI)气相色谱/质谱(GC/MS)、负化学电离(CI) GC/MS，以及气相色谱/串联质谱 (GC/MS/MS) 检测毛发中大麻素的方法已有报道，其限值仅为 SoHT 要求的1/100-1/20，但需要进行衍生化步骤3-10。 使用 LC/MS/MS 方法最大的优势在于无需衍生化，且该方法可用于筛查和确认性测试。然而，与 GC/MS/MS 法相比，LC/MS/MS 法在大麻代谢物的检测和定量方面存在不足， GC/MS/MS 在达到检测限时可提供丰度最高的信号。这一局限性最终会因毛发基质的复杂性而在LC/MS/MS 技术中产生，并观察到离子抑制。仅在临界浓度或更低浓度下的代谢物才会产生明显的上述效应。表1列出了目标分析物的特征。 材料和试剂 使用的材料如下： ( Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱， 3 mL， 300mg(部件号5190-1003)，用于处理 40 mg 毛发，以及1 mL，40 mg(部件号5190-1002 ) 或96孔板(部件号5190-1000)，用于处理 25 mg 毛发 ) ( Vac Elut 20 真空萃取装置， 带16×100 mm 试管收集架 (部件号12234103) ) ( Agilent I nfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl ， 3.0 × 150 mm， 1.9 pm (部件号693675-312)， Poroshell 120 Phenyl-Hexyl， 3×5 mm， 1.9 um， UHPLC 保护柱 (部件号823750-943) ) ( Agilent 129 0 Infinity Ⅱ在线过滤器，0.3 um (部件号5067-6189) ) 使用的化学品如下： ( 羧基-THC 和 羧基-THC-d3标准品分 别购自 Cerilliant 和 LGC ) ( GC 级正己烷和乙酸乙酯(EtOAc)， 以 及LC/MS级甲醇(MeOH)均购自J.T. Baker ) ( ACS 级氢氧化钠 (NaOH)和乙酸购自 Merck/Sigma ) 超纯水购自 Milli-Q 名称 Log P 分子式 结构 羧基-THC 6.21 C21H2804 COOH HH HC- CHsHC 标样和溶液 氢氧化钠1 mol/L(毛发消解溶液)：称取 NaOH (4 g) 置于烧杯中。用50mL 水溶解后，将溶液转移至100mL 容量瓶中。用少量水洗涤烧杯2-3次。将溶液超声处理1分钟，然后用水标定至容量瓶刻度。将溶液保存在带塑料盖的瓶中 注意：当水加入氢氧化钠时会释放热量。 ( 正己烷和 EtOAc (9：1 v/v) (毛发萃取 溶剂)：将90 mL己烷和10mL 乙酸 乙酯混合均匀 ) Me0H/水(80：20v/v) (CaptivaEMR-Lipid 溶剂)：将 80 mL甲醇和20 mL 超纯水混合均匀 ( 内标(IS) 一 羧基-THC-ds：用 MeOH 配制含8ng/mL 羧基-THC-d的 IS溶液，相当于基质中8 ng/g ) ( 校准曲线标样一羧 基- THC (CCS)： 用 MeOH 配制浓度分别为0.15、 0.2、0.4、 0 .8、 1.6和 3.2 ng/mL 的 六个校准标样 ) ( 质量控制 (QC)溶液(羧基-THC)：用 0.2 ng/mL 的溶液对批次进行质量控制。 在 开始分析之前，将 0.04 ng/mL的溶液进样至 LC/MS/MS 中评估系 统适用性 ) 样品前处理方法 依次用水、丙酮和二氯甲烷 (DCM) 对毛发样品进行1分钟的涡旋清洗。干燥毛发并将其剪成小块。随后，样品前处理方法包括四个阶段：1)毛发消解和预净化，2)液液萃取 (LLE)， 3) Captiva EMR-Lipid净化，以及4) LC/MS/MS 进样。 1.毛发消解 称取 40 mg 的负离子毛发置于顶空样品瓶中。建议使用硅烷化样品瓶，以防止静电作用导致毛发粘在样品瓶壁上。然后按如下方式对空白毛发样品进行加标： ( a)空白一加 入 40 uL IS ) ( b) 双空白(无IS) ) ( c) 标样1-6分别预加标40 uL 的校准曲线标准溶液，以及40 uL 的 IS溶液，使毛发中羧基-THC的最终浓度为 0.15、0.2、 0 .4、0.8、 1 .6和3.2 ng/g ) ( d) QC中预加标40 uL 的 QC 溶液和 40 uL的IS溶液，生成毛发中羧基-THC最 终浓度为 0.2 ng/g ) ( e) 将40 pL IS 溶液添加至剩余的样品中进行批量测试 ) 将加标的毛发样品平衡3分钟。加入2mL1 mol/L NaOH 溶液。将样品瓶加盖，于100℃下温育30分钟，然后冷却至室温。加入5mL 正己烷/EtOAc (9：1 v/v)。将样品涡旋混合1分钟，并在需要时以4000 rpm 的转速离心5分钟，实现明显的相分离。弃去上层有机层。加入2 mL乙酸并混合样品。 可使用采用25mg 毛发和 CaptivaEMR-Lipid 1 mL 过滤柱的另一种流程进行适当的体积调节。图2和图3显示了使用40和25mg样品量的方法工作流程。 2.液液萃取 (LLE) 加入5mL正己烷/EtOAc (9：1， v/v)。将样品涡旋混合1分钟，并根据需要进行离心。将上层转移至另一管内。重复两次以上此 LLE流程，转移并混合上层有机层。混合后的有机萃取液在50℃N流吹扫下挥干。然后用1.5 mL MeOH/水(8：2 v/v) 复溶干燥的样品，超声处理1.5分钟后涡旋混合30秒。 3. Captiva EMR-Lipid 净化 将 1.5mL 复溶样品转移至 CaptivaEMR-Lipid 3 mL 过滤柱中。通过重力以3-5秒/滴的速率洗脱样品。根据需要使用低真空。当过滤柱内无可见液体时，加入1 mL MeOH/水 (8：2 v/v) 进行二次洗脱。根据需要使用真空。洗洗液在50°℃N，流吹扫扫挥干。用150 uL MeOH 复溶干燥的样品，涡旋混合30秒后超声处理1.5分钟。将样品转移至带内插管的2mL样品瓶中，用于 LC/MS/MS 进样。 仪器方法 样品在 Agilent 1290 Infinity lI 液相色谱上运行，该系统与配备安捷伦喷射流iFunnel 电喷雾离子源的 Agilent 6495C三重四极杆液质联用系统联用。表2和表3显示了仪器方法的详细信息。 在每日的样品分析之前，通过进样0.04 ng/mL 的 MeOH标准溶液进行系统适用性测试。 参数 值 分析柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 Phenyl Hexyl (3.0×150 mm； 1.9 pm)和保护柱。自动进样器上的在线过滤器。 柱温 50°C 进样量 5 pL 流动相 A)含0.01%乙酸的水溶液 B)含0.01%乙酸的甲醇溶液 流速 0.5mL/min 梯度 5.00 8.00 时间(min) %A %B0.00 55 450.50 55 452.00 25 7525 7520 809.00 20 809.01 0 10012.00 0 10012.01 55 45 结束运行时间 12.02 后运行时间 3分钟 总运行时间 15分钟 表3.数据采集参数 Agilent 6495C 质谱条件 模式 MRM 干燥气温度 300°℃ 气化温度 450C 干燥气流速 13 L/min 雾化器压力 50 psi 毛细管电压 4500V 鞘气流速 12 L/min 鞘气温度 385°℃ 喷嘴电压 2000V 高压RF(+) 0 高压RF(-) 130 低压RF(+) 0 低压RF(-) 140 Delta EMV(-) 800 化合物名称 母离子 子离子 CE CAV 极性 羧基-THC 343.2 245.1 32 4 负 343.2 191.1 33 3 负 羧基-THCds 346.2 302.2 20 3 负 346.2 194.1 20 3 负 已发表了多种萃取毛发中羧基-THC的样品前处理方法。这些方法通常包括三个预处理步骤：1)毛发样品的清洁，2)切割或粉碎，以及3)称取 10-50 mg毛发用于样品分析。然后，将毛发置于酸性或碱性溶液中温育，并使用有机溶剂进行萃取。 本研究选择 NaOH进行碱性消解。然后使用 LLE 萃取毛发消解混合物，并用Captiva EMR-Lipid 过滤柱进行净化。整个方法由于可有效去除盐、蛋白质和脂质，因此可提供较高的回收率和较低的离子抑制。表4显示了用于毛发萃取和净化的典型样品前处理技术的比较。 如图4所示，在毛发0.15-3.2 ng/g的校准范围内，四次重复进样的校准曲线呈线性， R²>0.99。加标浓度 0.2 ng/g 毛发七次重复进样的回收率平均值保持在110%， RSD 为8.8%，加标浓度 0.8 ng/g毛发七次重复进样的回收率平均值保持在 101%， RSD 为 7.8%。如图5所示，6495C三重四极杆液质联用系统对羧基-THC加标浓度为 0.2 ng/g 的毛发的响应是6470A三重四极杆液质联用系统的三倍。图6显示了两种 MRM 下的毛发基质空白和处于临界浓度的五个重复样品。 表4.毛发基质中羧基-THC 的低定量限(0.0002 ng/mg)样品前处理方法的比较 样品前处理方法 优点 缺点 LLE ·在消解步骤中去除盐和蛋白质·易于应用 ·可萃取多种化合物 ·与目标分析物共萃取的脂质会导致仪器出现分析问题 ·高离子抑制，缺乏方法稳定性 进行 LLE 和不进行 LLE的SPE 阴离子交奂 ·在消解步骤中去除盐和蛋白质 ·最终的进样萃取物比 LLE的更干净·更高的分析物回收率 ·虽然萃取物比 LLE的更干净， 但仍存在高离子抑制 ·萃取和净化方案中包含更多步骤 进行 LLE 和不进行 LLE 的SPE 阳离子交换 ·在消解步骤中去除盐和蛋白质 ·最终的进样萃取物比 LLE的更干净·更低的离子抑制 ·与 LLE 和阴离子交换相比，萃取物更干净，但分析物回收率较低 ·萃取和净化方案中包含更多步骤 利用 Agilent Captiva EMR-Lipid 的LLE ·在消解步骤中去除盐、蛋白质和脂质 ·最终的进样萃取物比 LLE的更干净 ·更低的离子抑制 ·萃取和净化方案中包含更多步骤 图4.毛发中0.15-3.2ng/g 羧基-THC的校准曲线。蓝色三角形表示在毛发 QC样品0.2 ng/g 和0.8 ng/g 的临界浓度下重复萃取7次 -ESI MRM Frag= 120.0 VCID at 32.0(343.2→245.1) ×101 采集时间(min) Agilent 6495C ×10101-ESI MRM Frag = 380.0 V CID at 33.0 (343.2→191.1) -ESI MRM Frag = 380.0 V CID at 32.0 (343.2-245.1) 图 5.分别使用 Agilent 6470A 和 6495C 三重四极杆液质联用系统测定 0.2 ng/g 的毛发中羧基-THC的结果 ×101 一 ×10 ×101 ×10 ×101 ×10 ( 开发了一种使用 LLE 与 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化的稳定样品前处理方 法，并通过LC/MS/MS 分析毛发中的羧基-THC对其进行了验证。还使用 Agilent 6495C 和6470A三重四极杆液质联用系 统运行了毛发基质样品，并对两种系统的 灵敏度进行了比较，结果表明前者的灵敏 度比后者更佳。该方法经验证具有出色的 方法稳定性和灵敏度。已使用开发的方法 对数百个样品进行了常规分析。 ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 用于司法鉴定。 . 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( 2019年12月16日，中国出版 ) 5994-1635ZHCN ( 1. 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