牛奶中过敏原蛋白含量检测方案

TSKgelTECHNICAL INFORMATIONNo.191 LC/MS/MS法检测过敏原蛋白质(肽段) Separation of Peptides derived from Allergenic proteins by LC/MS/MS 食物过敏原的检测方法中，常用的定量法有ELISA法，常用的定性法有PCR法。这两种都是比较简便的方法，但是ELISA法由于对检测对象的过敏原有所限制，所以很难进行同时分析，而且会由于交叉反应导致检测错误。而PCR法的问题是在检测DNA时，无法直接检测过敏原蛋白。 因此，为了建立统一检测多种过敏原的检测方法，现在人们探讨的是使用LC/MS(把过敏原蛋白来源的肽段作为分析对象)的同时分析法。另外，为了防止过敏原种类不同而导致检测错误，人们对不同种类特异性肽段的同时检测的研究也在不断深入。本报告中，介绍了牛奶和鸡蛋中典型的过敏原蛋白来源的肽段的分离示例。 以α-酪蛋白、β-乳球蛋白、卵清蛋白这3种过敏原蛋白为对象，把还原烷基化之后经过胰蛋白酶消化的样品作为检测样品。为了提高实际样品分析时的稳定性，对每1种过敏原蛋白实行了6种肽段分析，并对每1种肽段设置了1~4组的SRM转换。使用了TSKgel ODS-100V 3 um的分析柱，在含有0.1%甲酸的水和乙腈的梯度洗脱条件下进行分析。 各肽段的SRM色谱图如图1所示。另外，肽段的氨基酸序列、保留时间和信号的线性范围消化前的 t原蛋白的浓度换算)如表1所示。可以确定所有分析对象在3级浓浓 范 中的线性。 图13种蛋白质来源的肽段的色谱图 表1中加粗斜体字转换成的色谱图 表1 分析对象肽的洗脱时间、转换及定量范围 B-Lactoglobulin Peptides R.t.(min) Precursorion (m/z) Product ion (m/z) Calibration range(mg/L) Peptides R.t.(min) Precursorion (m/z) Product ion(m/z) Calibrationrange(mg/L) HQGLPQEVLNENLLR 6.54 880.8 y11(+1)b4(+1) y15(+2) 880.51324.7436.2 0.5-5005-1，00010-1，000 GLDIQK 5.05 337.2 y4(+1)y2-17(+1)258.1 y3(+1) 503.3 388.3 0.05-500 0.2-500 0.5-500 FFVAPFPEVFGK 8.01 692.9 y8(+1) y9(+1) 920.5 991.5 y10(+1) 1090.6 0.05-500 0.2-500 0.2-500 IDALNENK 4.47 458.7 y6(+1) y7(+1) b2(+1) y4(+1) 688.4 803.4 229.1 504.2 0.1-500 0.1-500 0.5-500 0.2-500 YLGYLEQLLR 7.97 634.4 y6(+1)y8(+1)b2(+1)b4(+2) 771.5991.6277.2249.1 0.5-5000.1-5000.5-5000.5-500 VLVLDTDYK 6.23 533.3 y6(+1)y7(+1) b2(+1)y5(+1) 754.4853.4 213.2641.3 0.2-500 0.1-500 0.5-500 0.5-500 NAVPITPTLNR 5.88 598.3 y8(+2) b3(+1) 456.3 285.2 0.5-500 0.5-1，000 TPEVDDEALEK 5.42 623.3 y7(+1) y8(+1) y9(+1)y10(+2) 819.4 918.4 1047.5572.8 0.5-5001-1，0002-1，000 1-1，000 FALPQYLK 6.73 490.3 y5(+1)y6(+1)b2(+1) 648.4761.5219.1 0.2-1，0000.5-1，0000.5-1，000 ALNEINQFYQK 6.06 684.4 y6(+1)y7(+1)y9(+1) 1 827.4940.51183.6 10-1，0001-1，0001-1，000 ALPMHIR 5.63 419.2 y5(+2) y4(+1) y3(+1) y1-18(+1) 157.1 327.2 556.3 426.3 0.05-500 0.5-500 0.5-500 0.5-500 CLLLALALTCGAQALIVTQTMK 6.74 1138.1 y22(+2)1138.1 0.5-500 Peptides R.t.(min) Precursorion (m/z) Product ion (m/z) Calibrationrange(mg/L) LYAEER 3.59 390.7 y4(+1)y5(+1) 504.2667.3 1-1，0002-1，000 ELYR 3.81 580.3 y4(+1) 580.3 1-1，000 GGLEPINFQTAADQAR 6.26 844.4 y16(+2)y12(+2) 844.4666.3y12(+1)1331.7 C0.5-1，0005-1，0005-1，000 GLWEK 5.79 632.3 y5(+1) 632.3 1-1，000 VYLPR 5.60 324.2 y3(+1)y4(+1)y2(+1) 385.3548.3272.2 1-1，0000.5-5002-1，000 NVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFK 8.20 1230.7 y23(+2)1230.7 1-1，000 表2分析条件 ( ※“TSKgel”是东曹株式会 社在 日本的注册 商 标。 ) ( ※刊登的数据等并不确保其数值的正确或完 整 性。请您按照自己的使用环境、条件和判断基 准 重 新 确认。 ) 检测食品中过敏原蛋白质时，相比ELISA法或PCR法等传统方法，LC/MS/MS法的可靠性更高，且可以高通量、一次检测多种过敏原蛋白质。本篇应用介绍了LC/MS/MS法分析牛奶和鸡蛋中典型的3种过敏原蛋白（α-酪蛋白、β-乳球蛋白、卵清蛋白）的应用实例。实验中采用了C18色谱柱TSKgel ODS-100V(3um,2.0 mmI.D.×150mm)在含0.1%甲酸的水和乙腈的梯度洗脱条件下进行分析。