干海参中海参多糖的单糖组分分析检测方案(液相色谱柱)

检测器：紫外检测器，250 nm 海参多糖的单糖组分分析及色谱柱选择优化 海参多糖Polysaccharide of sea cucumber 【基本信息】 海参多糖是海参体壁的一类重要成分，其含量可占干参总有机物的6%以上。海参体壁多糖主要有两种：一为海参糖胺聚糖或黏多糖(holothurianglycosaminoglycan， HG)， 是由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L岩藻糖组成的分支杂多糖，；另一种为海参岩藻多糖(holothurianfucan， HF)， 是由L岩藻糖构成的直链匀多糖。两者的组成糖基虽不同，但它们糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化并且硫酸酯基占多糖含量均在32%左右。此外，有人从叶瓜参中分离获得硫酸低聚糖 frondecaside，其组成糖基与上述海参多糖HG或 HF迥异。值得注意的是，该寡糖不论从组成糖基及其构型还是从各糖苷键连接方式看，皆类似海参皂苷的寡糖糖。HG 和HF的结构特殊，都为海参所特有。 【样品的前处理】 萃取：将干海参粉碎至粉末，称取2g，加入40 mL60%乙醇水溶液，回流提取1h，重复提取3次，合并乙醇提取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发除去乙醇，提取物用20mL水溶解，加入20mL正丁醇，充分震荡，静置分层，吸取上层正丁醇层，按上述方法用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至干，即得海参皂苷粗提物。 水解：用2mol/L的三氟乙酸水溶液 2 mL 溶解粗提物，转移至水解管中密封，100℃水解2h，用4 mol/L 氢氧化钠溶液中和至 pH 值为6.5~7.5后转移入具塞试管中，加入1mL三氯甲烷，充分震荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法重复萃取3次，将上层水相转移至5 mL 容量瓶中，用水定容，即得海参皂苷水解液。 衍生：移取上述海参皂苷水解液、单糖标准品溶液与单糖混合溶液 0.5 mL于2个5mL反应管中，各加入0.5 mL PMP 衍生剂溶液与 0.5 mL 0.3 mol/L 氢氧化钠水溶液，混合均匀后，70℃水浴反应 90 min， 取出冷却至室温，各加入0.5 mL 0.3mol/L 盐酸水溶液中和。 净化：将上述海参皂苷水解液、单糖标准品溶液与单糖混合溶液的衍生液，加入1mL三氯甲烷，充分震荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次，将上层水相过0.45 um 滤膜过滤，进样。 空白样品：将PMP衍生剂按上述衍生与净化实验步骤进行。 【分析条件】 仪器： Agilent 1120 色谱柱：TSKgel ODS-100V (4.6mm I.D.×15 cm， 5um) 流动相：25 mmol/L 磷酸二氢钾-乙腈溶液(82：18体积比) pH=6.7 流速： 1.0mL/min 柱温： 室温 进样量：20pL 【分析结果】 图1 单糖混合溶液衍生物的色谱图 峰序号 对照品名称 保留时间 线性范围 标准曲线 相关系数R² (min) (mg/mL) 1 甘露糖衍生物 13.623 0.0018~0.453 y=73939x-38.917 1 2 鼠李糖衍生物 19.137 0.0017~0.1389 y=64099x-48.03 0.9999 3 葡萄糖醛酸衍生物 23.407 0.0016~0.1318 y=59819x+30.375 0.9998 4 半乳糖醛酸衍生物 26.533 0.0013~0.1062 y=56109x+15.251 0.9999 5 乳糖衍生物 28.567 0.0018~0.1465 v=32337x-7.3354 1 6 葡萄糖衍生物 31.753 0.0029~0.2342 v=62764x-31.355 1 7 半乳糖衍生物 36.703 0.0012~0.0960 y=74826x-7.8469 1 8 阿拉伯糖衍生物 40.597 0.0012~0.0960 y=90060x-27.159 1 9 L-岩藻糖衍生物 47.733 0.0008~0.0653 v=39732x-4.9802 1 10 喹诺糖衍生物 49.180 0.0009~0.0712 y=34416x-4.6745 1 图2海参多糖水解衍生物的色谱图 峰序号 对照品名称 保留时间(min) 理论塔板数 分离度 1 甘露糖衍生物 13.630 9452 - 2 葡萄糖衍生物 31.867 9700 19.67 3 半乳糖衍生物 36.537 - 4 L-岩藻糖衍生物 47.937 1729 - 5 喹诺糖衍生物 49.397 9109 0.43 结论 TSKgel ODS-100V(4.6 mmI.D.×15 cm， 5um)可以将多种单糖衍生物(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)很好的分离，以浓度 mg/mL 为横坐标、峰面积为纵坐标作标准曲线回归方程，可计算出供试品干海参中海参多糖水解后各单糖物质的量之比，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖、喹诺糖的物质的量比为1.0：22.3：1.0：1.3：4.1。 由于水产行业标准 SC/T 3049-2015中需要加入乳糖作为内参比，故在此试验中加入乳糖。此外，L-岩藻糖与喹诺糖互为同分异构体而无法彻底分离。 【分析条件】 仪器： Thermo Ultimate 3000 色谱柱：：TSKgel ODS-140HTP (2.1 mm I.D.×10 cm， 2.3 um) 流动相：25 mmol/L 磷酸二氢钾-乙腈溶液 (82：18 体积比) pH=6.7 流速： 0.2 mL/min 柱温： 室温 进样量：5pL 检测器：紫外检测器， 250 nm 【分析结果】 图1 单糖混合溶液衍生物的色谱图 峰序号 对照品名称 保留时间(min) 分离度 7不对称因子 理论塔板数 1 甘露糖衍生物 4.647 - 1.39 10596 2 鼠李糖衍生物 6.218 7.69 1.30 11771 3 葡萄糖醛酸衍生物 8.542 7.12 2.02 6458 4 半乳糖醛酸、乳糖衍生物 9.672 2.41 1.11 5618 5 葡萄糖衍生物 10.845 2.62 1.19 13015 6 半乳糖衍生物 12.462 4.10 1.14 14798 7 阿拉伯糖衍生物 13.772 2.87 - 11899 8 L-岩藻糖衍生物 16.273 4.69 0.99 13322 9 喹诺糖衍生物 18.008 2.97 1.06 13999 结论： TSKgelODS-140HTP (2.1 mmI.D.×10cm， 2.3 um)可以将多种单糖衍生物(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、L-岩藻糖、喹诺糖)很好的分离，并且相较于 ODS-100V 分析时间大幅缩短，流动相使用量仅为1/5，完全分离了L-岩藻糖与喹诺糖，符合国家标准 GB/T 33108-2016与水产行业标准 SC/T 3049-2015的要求。 此次实验对色谱柱的选择进行了优化，单糖的种类也相较于其他单糖衍生文献多一些，涵盖了绝大部分单糖的衍生化分析。 本实验对海参多糖分析的色谱柱选择进行了优化，采用了TSKgel ODS-140HTP（2.1 mmIDX10 cm,2.3um）可以将多种单糖衍生物（甘露醇、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、L-岩藻糖、喹诺糖）很好的分离，并且相较于ODS-100V色谱柱分析时间大幅缩短，流动相使用量仅为1/5，完全分离了L-岩藻糖与喹诺糖，符合国家标准GB/T33108-2016与水产行业标准SC/T3049-2015的要求。