鱼肉中ATP有关的物质、组胺和氨基酸检测方案(液相色谱仪)

Application'n NoNo.L554News 岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2019年12月400-650-0439 高效液相色谱法 NexeraTM 双进样系统快速测定鱼肉的新鲜度和变质状态 -同时分析鱼肉中与 ATP 有关的物质、组胺和氨基酸 众所周知，鱼贝类的肌肉与畜产动物相比，组织较为柔软、水分较多，因此容易变质。正确判定这些鱼贝类的新鲜度，对保证食品的安全非常重要。 使用Nexera 双进样系统，可以通过将样品注入两个独立的流路同时分析。此外，由于将获得的两个分析数据存储在一个数据文件中，因此对同一样品的综合分析和数据管理非常容易(图1)。 目前广泛使用的一种方法是利用与动物肌肉能能ATP(腺苷三磷酸)有关物质的变化作为肌肉新鲜度的指标，此外，在对鱼肉新鲜度进行评估时经常使用K值。 在本文中，分别使用光电二极管管列(PDA)检测器(SPD-M40)和荧光检测器 (RF-20AXS)检测ATP相关物质和包括组胺在内的氨基酸。 另一方面，近年来，有报道称作为非挥发性变质胺的组胺会引起的食物中毒，导致过敏病症。金枪鱼等红肉鱼变质后，会累积高浓度的组胺(氨基酸之一的组氨酸的代谢物)。组胺具有热稳定性，在烹饪过程中不能去除，一旦产生，就无法预防食物中毒。因此，以国际食品标准委员会 (Codex) 和欧洲为首的各国制定了组胺的限值标准。 目标成分 目标成分共有31种，包括6种ATP相关物质，组和24种氨基酸(20种蛋白质和4种与鱼肉有关的成分)。表1显示了目标成分。 L536号应用介绍了一个测定鱼肉K值并针对新鲜度随时间的变化创建多数据报告的例子。在此，我们介绍一个使用Nexera 双进样系统同时分析作为新鲜度指标的K值、作为变质状态指标的组胺的例子。此外，在本文的分析条件下，还可以同时分析鱼肉中所含的、以鲜味为人们所知的营养成分-氨基酸和核酸。 表1目标成分 N. Iwata 可同时进行两个系统分析的双进样系统 ATP-related com pounds *1 10 Serine 21 Tyrosine 1 Hx 11 Glutamin 22 Valine 2 IMP 12 Glycine 23 Methionine 3 HxR 13 Histidine 24 Histamine 4 AMP 14 Threonine 25 Cystine 5 ADP 15 B-Alanine 26 Tryptophan 6 ATP 16 Arginine 27 Phen ylalanine Histamine and amino acids 17 Alanine 28 Isoleucine 7 Aspartic acid 18 Taurine 29 Leucine 8 Glutamic acid 19 Anserine 30 Lysine 9 Asparagine 20 Carnosine 31 Proline 通常，在分析与 ATP相关的物质和氨基酸(包括组胺)时，两者所用的分析条件(例如流动相，分析色谱柱和检测器)是不同的，因此，需要使用2台HPLC 分别进行分析，或者使用1台 HPLC 实施2次分析。但是，对于随时间变化的样品(例如新鲜度或变质状态)，应尽快获得结果。 *1：Hx：Hypoxanthine，HxR： Inosine， IMP： Inosine 5'-monophosphate，AMP： Adenosine 5'-monophosphate，ADP： Adenosine 5'-diphosphate， ATP： Adenosine 5'-triphosphate Dual injection system of ATP-relatedcompounds， histamine and amino acids 图1单个系统(左)和双进样系统(右) 预处理方法以及 HPLC分析条件 使用金枪鱼作为样品。用高氯酸萃取后除去蛋白质，然后进行中和，用HPLC 进行分析”(图2)。 分析条件如表2所示。ATP相关物质，组胺和24种氨基酸通常通过梯度洗脱来分离，将在多样品分析中反复获得稳定结果的条件作为梯度洗脱的条件。组胺和氨基酸的分析，需要使用邻苯二甲醛(OPA)和9-芴基甲基氯甲酸酯 (FMOC)进行荧光衍生，自动进样器即可自动进行柱前荧光衍生(表3和4)。这样就无需进行复杂的手动预处理(例如丹磺酰氯衍生化)，并保证了从衍生化到开始分析的时间保持恒定。 此外，在本文中，使用了低吸附玻璃瓶 TORASTTM-HGlassVial(图3)。该样品瓶有两个产品系列：1.5mL和小容量的150 uL。衍生化试剂和衍生化前的样品使用1.5 mL小瓶，样品和衍生化试剂反应的小瓶，使用在少量的情况下也易于混合的150 pL小瓶。图4显示了自动进样器的样品设置。Nexera 的自动进样器SIL-40系列可以设置三个样品架，因此如图4所示，通过为每种用途设置不同样品瓶，可以防止样品设置错误。 图2预处理方案 表3柱前自动衍生流程 表4衍生试剂的制备 ( M ercaptopropionic a c id solution Add 10 pL of 3-mercaptopropionic acid into 1 0 n mL of 0. 1 mol/L borate b uffer. ) OPA Reagent Add 0.3 mL of ethanol into 10 mg of o-phthalaldehyde anddissolve completely. Then add0.7 mL of 0.1 mol/L borate buffer and4 mL of ultrapure water. FMOC Reagent Dissolve 10 mg of 9-fluorenylmethyl c hloroformate into 50 mL ofacetonitrile. ： Standard for Injection port 1 ： Standard before derivatization ◎： Sample for Injection port 1 and before derivatization .O： Standard or sample after derivatization for Injection port 2 ： Derivatization reagent 表 2 分析条件 预处理萃取溶剂和添加回收率的确认 此前已经报道过用高氯酸提取 ATP 相关物质的预处理方法，我们讨论了是否可以同样地提取组胺和氨基酸。作为实验空白，分别添加1umol组胺和组氨酸，以水和高氯酸进行萃取，两者均能获得稳定的萃取效率(表5)。 另外，使用金枪鱼，根据“食品中农药残留等相关试验方法的稳定性评价指南”，同时进行6个添加回收试验。添加组胺使浓度达到国际食品标准委员会(Codex)的标准浓度(10mg/100g)，静置30分钟后，同时处理6个样品。添加回收试验结果如表6所示。准确性(回收率的平均值)和精密度的结果都很好。 表5萃取溶剂不同时组胺和组氨酸的萃取效率 N Extraction efficienc y(%) Histamine Histidine Water Perchloric acid Water Perchloric acid 1 84.0 97.7 93.8 92.5 2 100.8 95.7| 102.1 93.0 表6组胺的添加回收试验(N=6) N Recovery rates (%) 1 96.8 2 98.3 3 99.8 4 99.8 5 101.0 6 103.0 Average(%RSD) 99.8(2.14%) 校准曲线 针对31种目标成分创建校准曲线，所有成分的相关系数均在R=0.999以上，线性良好。表7所示为各成分的校准曲线浓度范围和相关系数(表7)。 鱼肉中的ATP相关物质、组胺和氨基酸的同时分析以及k值、组胺浓度测定 使用生黄鳍金枪鱼，在购买后立即预处理，与改变储存温度一天后预处理进行比较分析，确认K值和组胺浓度。储存温度为冷藏保存(4°C)和室温(25°C)。购买一天后(存储在4°C下)进行预处理与购买后立即预处理相比较，K值略有增加(+1.4%)，并且观察到新鲜度随时间发生了变化。此外，比较储存温度时，K值在25°C时明显增加(+25.1%)，并且新鲜度下降，但是没有生成组胺。同样，确认了购买后冷藏储存6天的鲜长鳍金枪鱼的K值和组胺浓度。结果显示K值增加到70.4%，达到所谓的变质区域，并且检测到低于 Codex标准值的组胺。浓度为 2.1 mg/100 g。图5为标准品和金枪鱼中目标成分的色谱图，表8显示了经过不同天数、不同储存温度下的金枪鱼K值和组胺浓度。此外，还可以从许多氨基酸中分离并检测出组胺，也可同时分析鱼肉中常见的组氨酸、丙氨酸、牛磺酸、鹅肌肽、肌肽和赖氨酸等成分。表9显示了黄鳍金枪鱼中常见的核酸与氨基酸的浓度。 表8经过不同天数、储存温度下的金枪鱼K值和组胺浓度 days Temperature (℃) K value*3(%) Histamine(mg/100 g) Yellowfin Tuna 0 4 36.1 N.D. 1 4 38.7 N.D. 25 61.2 N.D. Albacore Tuna 6 4 70.4 2.1 *3 Definition formula for K value 表7校准曲线浓度范围和相关系数(R) Compound Conc. range (umol/L) R2 Compound Conc. range (umol/L) R2 1 Hx 1-300 0.99982 17 Alanine 0.25-100 0.99994 2 IMP 1-300 0.99983 18 Taurine 0.25-100 0.99995 3 HxR 1-300 0.99984 19 Anserine 0.25-100 0.99997 4 AMP 1-300 0.99987 20 Carnosine 0.25-100 0.99995 5 ADP 1-200 0.99998 21 Tyrosine 0.25-50 0.99995 6 ATP 1-200 0.99944 22 Valine 0.25-50 0.99995 7 Aspartic acid 0.25-50 0.99994 23 Methionine 0.25-50 0.99996 8 Glutamic acid 0.25-50 0.99995 24 Histamine 0.25-50 0.99999 9 Asparagine 0.25-50 0.99995 25 Cystine 0.25-25 0.99953 10 Serine 0.25-50 0.99995 26 Tryptophan 0.25-50 0.99993 11 Glutamin 0.25-50 0.99995 27 Phen ylalanine 0.25-50 0.99995 12 Glycine 0.25-100 0.99996 28 Isoleucine 0.25-50 0.99995 13 Histidine 0.25-100 0.99968 29 Leucine 0.25-50 0.99996 14 Threonine 0.25-50 0.99994 30 Lysine 0.25-100 0.99995 15 B-Alanine 0.25-50 0.99991 31 Proline 1-25 0.99953 16 Arginine 0.25-50 0.99994 图5标准品和金枪鱼(黄鳍、长鳍)目标成分的色谱图 Yellowfin Tuna (0 day)(umol/L) *4 2 IMP 278.9 8 Glutamic acid 46.6 13 Histidine (2416.0) 17 Alanine 55.7 18 Taurine 27.8 19 Anserine (1062.5) 20 Carnosine 82.0 22 Valine 23.6 29 Leucine 20.4 30 Lysine 50.7 *4 Values in parentheses are outside the quantification range. ( [参考文献] ) ( 1)臼井一茂、渡边悦生、关于冷冻及生鲜蓝枪鱼的K值产生的新鲜度变化的比较、神奈川县水产技术中心研究报告，第5号，11-14 ( 2012年) ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 众所周知，鱼贝类的肌肉与畜产动物相比，组织较为柔软、水分较多，因此容易变质。正确判定这些鱼贝类的新鲜度，对保证食品的安全非常重要。目前广泛使用的一种方法是利用与动物肌肉能源ATP（腺苷三磷酸）有关物质的变化作为肌肉新鲜度的指标，此外，在对鱼肉新鲜度进行数值评估时经常使用K值。另一方面，近年来，有报道称作为非挥发性变质胺的组胺会引起的食物中毒，导致过敏病症。金枪鱼等红肉鱼变质后，会累积高浓度的组胺（氨基酸之一的组氨酸的代谢物）。组胺具有热稳定性，在烹饪过程中不能去除，因此一旦产生，就无法预防食物中毒。因此，以国际食品标准委员会（Codex）和欧洲为首的各国制定了组胺的限值标准。 L536号应用介绍了一个测定鱼肉K值并针对新鲜度随时间的变化创建多数据报告的例子。在此，我们介绍一个使用Nexera双进样系统同时分析作为新鲜度指标的K值、作为变质状态指标的组胺的例子。此外，在本文的分析条件下，还可以同时分析鱼肉中所含的、以鲜味为人们所知的营养成分-氨基酸和核酸。