磷酸催化合成半乳聚糖中结构分析检测方案(微波合成仪)

研究论文DOI：10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.01.005 JIGao，et al：Preparationand Structural Characterization ofGalactansSynthesized by Phosphoric AcidCatalyzation under Microwave IrradiationRESEARCH ARTICLE 微波辅助、磷酸催化合成半乳聚糖的结构分析 纪高，三王海松，丁寅翼，成向荣：*1，2，乐国伟12 (1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122) 摘要：以磷酸催化、微波辅助合成半乳聚糖为研究对象，探讨半乳聚糖的化学结构及聚合反应的区域选择性和立体选择性。综合采用高效凝胶渗透色谱、红外光谱、甲基化分析及一维、二维核磁兹振波谱('HNMR，C NMR，'H-'H COSY，TOCSY，HSQC，HMBC)，对半乳聚糖的相对分子质量、糖苷键的立体构型和连接位点进行表征。结果表明，反应合成的半乳聚糖为多分支结构，重均相对分子质量为2657，重均聚合度为16，糖残基以α-型半乳吡喃糖为主，主要为→4)-a-D-Galp(1→和→2，4)-a-D-Galp(1→片段。结构分析结果进一步表明，微波辅助、磷酸催化半乳糖缩合过程中，不同位点的羟基具有不同的反应活性，4位羟基的反应活性最强。 关键词：微波；磷酸；半乳聚糖；结构分析 中图分类号：TS 245.9 文献标志码：A 文章编号：1673—1689(2017)01—0027—07 Preparation and Structural Characterization of Galactans Synthesized byPhosphoric Acid Catalyzation under Microwave Irradiation JI Gao， WANG Haisong， DING Yinyi， CHENG Xiangrong*12， LE Guoweil.2 (1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122， China；2. State Key Laboratoryof Food Science and Technology， Jiangnan University ， Wuxi 214122 ， China) Abstract： Galactans synthesized by phosphoric acid catalysis and microwave irradiation werestudied for their chemical structures and regio- and stereo-selectivities during the polymerization.Aseries ofanalysesincluding high-performancegel-permeationchromatography，infraredspectroscopy，methylation analysis and NMR spectroscopies ('H，C，H-H COSY，TOCSY，HSQC，HMBC) were used. Results showed that the degree of galactosyl polymerization was 16 and the-galactopyranosyl residues were dominant mainly with→4)-a-D-Galp (1→and→2，4)-a-D-Galp(1→ fragments. Structural analyses further indicated that the activities of hydroxyls in galactose weredifferent and the 4-OH exhibited the highest potency. Keywords： microwave，phosphoric acid，galactan， structural analyses 半乳聚糖是一类广泛存在于海洋藻类、陆生植 物或动物组织中，由半乳糖或以半乳糖为主、其它 ( 收稿日期：2015-03-24 ) ( 基金项目：国家“十二五 ” 科技支撑计划项目(2012BAD33B05)。 ) ( *通信作者：成向荣(1985一)，男，浙江永康人，医学博士，副教授，主要从事食品营养与功能因子研究。E-mail：cheng- x iangrong@hotmail.com ) ( 引用本文：纪高，王海松，丁寅翼，等.微波辅助、磷酸催化合成半乳聚糖的结构分析[].食品与生物技术学报，2017，36(01)：27-33. ) 单糖为辅构成的直链或支链聚合物"。半乳聚糖，尤其是来源于藻类的半乳聚糖硫酸酯，具有增强免疫、抗病毒、抗凝血及抑制肿瘤转移的生物学功能2-5。此外，半乳聚糖作为一类膳食纤维，还可以有效促进肠道乳酸菌增殖，提高肠道短链脂肪酸的含量量。 目前，半乳聚糖的制备主要依赖于天然资源的提取、水解和衍生。天然资源的生长周期性和提取工艺的复杂性严重制约了半乳聚糖的深入开发和应用。结合糖在酸催化、加热条件下可脱水缩合的特点，以及微波辐射具有加热均匀、快速的优势，作者研究了微波辅助快速合成低聚糖、多糖的技术，并分别以葡萄糖、甘露糖、半乳糖为原料，在杂多酸催化下，快速、高收率地合成了相应低聚糖或多糖7糖类物质的化学结构中普遍存在多个位点的异构，包括区域异构及立体异构，即糖苷键不同连接位置、不同立体化学的异构形式，是化学法合成低聚糖、多糖过程中面临的主要挑战[10-121，也是微波辅助合成聚糖过程中亟待解决的科学问题。若能够掌握微波辐照、酸催化单糖聚合过程中的区域选择性和立体选择性规律，那么，微波辅助定向合成低聚糖、多糖将有可能成为现实。 王海松等对微波辐照、杂多酸催化半乳糖聚合的反应进行了优化，并对反应产物进行了初步的化学表征，结果发现合成的半乳聚糖平均聚合度为17，半乳糖残基以β-构型为主，但糖苷键的连接位置尚未阐明。作者在上述优化条件的基础上，以半乳糖为原料，采用食品中常用的酸化剂——磷酸为催化剂，微波辐照合成半乳聚糖，并对合成产物进行细致的结构分析，总结半乳糖聚合过程中的区域选择性和立体选择性 材料与方法 1.1 材料与试剂 D-半乳糖(Gal)、氯化钠、磷酸、三氟乙酸、无水乙醇(99%)：国药集团化学试剂有限公司产品；重水(D20)：上海晶纯生化科技股份有限公司产品；Sephadex G-25 葡聚糖凝胶：北京索莱宝科技有限公司产品。 1.2 仪器与设备 XH-200A 型电脑微波固液相合成/萃取工作站：北京祥祥科技发展有限公司产品；BSZ-100 型自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂产品；R-205 型旋转蒸发仪：无锡申科公司产品；1260型高效液相色谱仪(配Shodex RI-101示差检测器)：美国Agilent 公司产品；ICS-5000型离子色谱仪器：美国Dionex 公司产品；600型高效凝胶渗透色谱仪(配2410视差检测器)：美国 Waters 公司产品；7890A-5975C 型气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦公司产品；560傅里叶变换红外光谱仪：美国 Nicolet 公司产品；DRX-500核磁共振仪：德国Bruker 公司产品。 1.3 方法 1.3.1 半乳聚糖的合成和纯化 半乳聚糖的合成和纯化参考王海松等的方法。25gD-半乳糖与1.1%磷酸、3.75mL氯化钠溶液(0.25 mol/L)充分觉拌混匀后送入微波反应器。设定微波功率800W、反应温度130℃、反应时间4.5 min， 开启搅拌器120 r/min，并开启微波合成仪。反应结束后，得淡黄色胶状固体。反应产物溶于去离子水中，经5倍体积的无水乙醇沉淀后，弃上清液。多糖沉淀加去离子水复溶，采用 Sephadex G-25 葡聚糖凝胶色谱柱分离，以去离子水作洗脱剂，流量0.5 mL/min，用部分收集器收集洗脱液，每管收集量为3mL，时间间隔6 min。收集液中的糖组分采用硫酸-苯酚法测定测3，检测波长为490 nm，以吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。收集各管洗脱液，旋转蒸发浓缩后，冻干得白色粉末状样品。 1.3.2 相对分子质量测定 采用高效凝胶渗透色谱法测定半乳聚糖的相对分子质量。标准品和样品溶液：标准葡聚糖 Dextran(相对分子质量为828，2700，9 750，36 800，13 5350，Sigma-Aldrich 公司产品)；葡萄糖：Sigma-Aldrich 公司产品；用流动相配成质量浓度为 5 g/L的溶液，然后于5000 r/min 速率下离心10 min，取上清；色谱柱：TSKgel G3000PWXL凝胶色谱柱(300 mmx7.8 mm，日本 TOSOH公司)；流动相：0.1 mol/L NaNOz含 0.5 g/L NaN3；流量：0.9mL/min；柱温：45℃；进样量：20uL。将系列标准葡聚糖和葡萄糖相对分子质量的对数LgM对其相应的保留时间tR进行回归处理，得出线性回归方程。 1.3.3 半乳聚糖红外光谱分析 称取半乳聚糖样品1.3 mg，加入200 目的KBr粉末150 mg，于红外灯照射下，在玛瑙乳钵中研磨均匀，装入压片磨具，用油压机以20 MPa 的压力压制2 min，然后用镊子小心取下压片，装入样品架，用 Nicolet 560 傅里叶 变换红外光谱仪于 500~4000 cm范围内扫描红外光谱。 1.3.4 甲基化分析 半乳聚糖的甲基化分析参考Hakomori 的方法4。20 mg干燥的半乳聚糖样品溶解于6mL DMSO 中，室温振荡2h。在氩气保护下加入甲基亚磺酰负离子(30 mg的 NaH 固体溶解于3 mL 无水 DMSO中，温度控制在50~55℃，搅拌至反应液呈墨绿色，得甲基亚磺磺负离子)，常温下磁力搅拌至颜色退去，冰浴后缓慢加入4mL碘甲烷，至溶液逐渐变为淡黄色。反应结束后加入少量蒸馏水终止反应，然后将生成物透析，冷冻干燥得甲基化半乳聚糖。向上述甲基化半乳聚糖中加入1mL甲酸，110℃水解6h，加热除去甲酸，再加入2mL浓度为 2 mol/L 的三氟乙酸，置于安部瓶中，充惰性气体密封后100℃反应6h，氩气流中冷冷、干燥。在水解产物中加0.6 mL 去离子水和50 mg NaBH4，室温下过夜，加少量甲酸至无气泡，加甲醇蒸干。然后加入1mL的吡啶-乙酸酐(体积比为1：1)，100℃反应2h，旋蒸干燥后加氯仿溶解，进行 GC-MS 分析，进样量为1~2 uL。 GC-MS 分析色谱柱：AgilentDB-5ms(30 mx0.25 mmx0.25 um)；载气流量(氦气>99.99%)：1.0 mL/min，分流比1：50；程序升温：80℃，保留5 min，以15℃/min 升至200℃保留l min，再以10℃/min 升至260℃，保留 10 min；接口温度250℃；EI源：70eV，250℃，扫描频率5次/秒，质量范围：33~600 amu。数据分析采用 AMSD 化学工作站软件(version E.02.02.1431)和 NIST11 数据库。 1.3.5 核磁共振波谱分析 半乳聚糖样品前处理参考 Hu 等的方法。25 mg 半乳聚糖溶解于 0.4 mL重水中，振荡15 min，溶解后冻干，该步骤重复操作3次。最后将冻干的半乳聚糖样品溶解在 0.4 mL重水中，Bruker DRX-500核磁共振光谱仪检测，记录'H-NMR，1C-NMR，1H-1H COSY，TOCSY，HMBC，HSQC 谱。H-NMR 和"C-NMR 光谱测定频率分别为500.13和125.77MHz，样品测定温度65℃。 2.1 半乳聚糖的制备 中强酸可以促进糖苷键原子的质子化，加快多糖的水解和单糖的缩合。王海松等采用微波辅助、杂多酸催化方法快速合成了半乳聚糖，并对合成工艺进行了优化。在本实验中，根据优化后的反应条 件，采用食品工业中常用的磷酸代替杂多酸来催化半乳糖的聚合。反应产物经过除杂、柱色谱分离，得到半乳聚糖22.6 g，反应得率为90.4%，与文献[9]结果相近。实验结果表明，磷酸能够快速催化半乳糖聚合，与杂多酸相比，磷酸具有引入杂原子更少、反应产物更易处理的优势。 2.2 相对分子质量测定 根据系列标准葡聚糖、葡萄糖溶液的保留时间，以保留时间 t对相对分子质量的对数lg M、作图，结果见图1。多糖相对分子质量在180~135350范围内，Lg M、与 tr 呈良好线性关系，回归方程为LgM=0.437 7tR+12.368，R=0.9988。 图1 葡萄糖和葡聚糖标准曲线 Fig.1 Calibration curve of glucose and dextrans 经过乙醇沉淀和柱色谱分离纯化后，半乳聚糖的高效凝胶渗透色谱行为如图2所示，为单-一、狭窄、对称的色谱峰，表明制备得到的半乳聚糖纯度较高。分析结果表明，半乳聚糖的重均相对分子质量(M)为2657，数均相对分子质量(M)为2215，峰位相对分子质量(M，)为2196，重均聚合度为16，分子质量分布系数(HI=MJM)为1.19。HI值趋近于1，表明分离纯化后的半乳聚糖分子质量的多分散程度小，合成制备的半乳聚糖分子质量分布较为均一。 2.3 红外光谱分析 实验合成的半乳聚糖和D-半乳糖的红外光谱图如图3所示。与D-半乳糖相比，半乳聚糖位于3000~3 700 cm卜处的O一H伸缩振动吸收峰较为宽钝，提示半乳聚糖中存在丰富的、不同化学环境的羟基基团。王海松等认为1 647 cm-处是 C=0振动吸收峰，但C=0振动一般出现在1725~1730cm-处，这与红外光谱信号并不一致，并且在'H和利CNMR图谱(图4)中未观察到与羰基或羧基相对应 的化学位移信号。水的特征吸收峰出现在3420cm和1630cm-附近，故而推测1647 cm-处是水的吸收峰，表明半乳聚糖中存在微量的水分。D-半乳糖和半乳聚糖在1000~1200 cm处存在3个强吸收峰，表明两者均为吡为型糖苷。877 cm-和793cm处的吸收峰表明半乳聚糖中存在α-和β-构型的半乳糖残基。 图2 半乳聚糖的高效凝胶渗透色谱分析 Fig. 2 High performance gel permeation chromatographyof galactan 图3 微波辅助合成半乳聚糖和D-半乳糖的红外光谱图 Fig. 3FT-IR spectra of synthesized galactan and galactose 2.4 甲基化分析 从半乳聚糖的甲基化结果(表1)可以看出，该多糖中半乳糖的主要连接方式为1，4和1，2，4连接，比例约为1.5：1，而文献报道红藻来源的半乳聚糖的主链以1，3和1，4连接为主16-17。此外，微波辅助合成的半乳聚糖结构中还存在部分的1，6连接型半乳糖唐基，以及少量的1，3和1，4，6连接的半乳糖结构片段，而1，2和1，3，6连接的半乳糖残基含量极低。这些结果表明，在反应过程中，半乳糖上不同位置羟基的反应活性不同，4-OH>6-0H>3-OH>2-0H。2，3，4，6-Me4-Gal为半乳糖末端，含量为4.2%，表明半乳聚糖具有较高的聚合度，与相对分子质量的测定结果一致。 表1 半乳聚糖的甲基化分析 Table 1 Methylation analysis of synthesized galactan 糖衍生物 连接形式 摩尔分数/% 2，3，4，6-Me4-Gal Gal(1→ 4.2 3，4，6-Mes-Gal →2)Gal(1→ <0.1 2，4，6-Mez-Gal →3)Gal(1→ 3.5 2，3，6-Mez-Gal →4)Gal(1→ 46.9 2，3，4-Mez-Gal →6)Gal(1→ 11.5 3，6-Mez-Gal 一2，4)Gal(1→ 30.7 2，4-Mez-Gal 一3，6)Gal(1→ <0.1 2，3-Mez-Gal →4，6)Gal(1→ 1.9 2.5 核磁共振波谱分析 核磁共振波谱是多糖结构解析过程中的一个强有力的工具，能够提供更多糖残基的平面结构和立体构型信息。在半乳聚糖的H-NMR谱(图4(a))中，大多数的端基质子化学位移出现在85.02~5.30(J=0~2 Hz)处，而少数端基质子信号位于8 4.49(d，J=5.5 Hz) 和84.63 (d，J=6.0 Hz)，83.5~4.4为半乳糖残基 H-2~H-6的质子信号。一般地，在以重水为溶剂的核磁测试中，吡喃型糖残基的α-构型端基质子出现在85~6，偶合常数为2~4 Hz；而β-构型端基质子出现在84~5，偶合常数为6~8 Hz8。因此，合成半乳聚糖主要以α-构型为主，同时有少量的β-构型半乳糖残基。这与王海松等的分析结果截然相反，可能是由于不同氘代试剂对质子化学位移的影响，从而导致分析结果不一致。在王海松等合成的半乳聚糖的1H NMR图谱分析中，采用氛代二甲基亚砜为溶剂，致使端基质子的核磁信号集体往高场移动约0.3×10-6，却以重水为测试试剂时的构型判别规律为参照，这这不恰当的。在IC-NMR谱中，半乳聚糖的端基碳化学位移主要集中在899~110，而 C-2~C-6的信号集中在863~85，未观察到羰基或羧基的化学位移信号(图4(b))。 图4 聚半乳糖的'H(500MHz)和"C(125 MHz)核磁共振谱图 Fig. 41H and C NMR spectra of synthesized galactan(500 MHz for H NMR and 125 MHz for 3CNMR in D，O) 根据半乳糖残基 H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H2-6质子的相关性，分析反映邻近质子偶合相关性的'H-'H COSY 谱和反映同一自旋体系中质子标量偶合相关性的 TOCSY 谱(图5)，对不同连接型半乳糖残基的质子信号进行归属，结果如表2所示。以β-构型半乳糖残基端基质子信号84.49为例，在TOCSY 谱中，84.49与83.60，3.70，3.98，4.02有较强的相关信号，表明这5个质子存在于同一个半乳糖残基中；结合 'H-H COSY 谱中 8 4.49 与3.60 的相关信号，推断H-2的化学位移为83.60，进而根 (b) 图5半乳聚糖的'H-H COSY 和 TOCSY 核磁共振谱图 Fig.5 H-H COSY and TOCSY spectra of synthesized galactan 图6 半乳聚糖的 HSQC 和 HMBC 核磁共振谱图 Fig.6 HSQC and HMBC spectra of synthesized galactan 据H-2/H-3的相关信号，推断 H-3的化学位移为83.70；类似地，最终推导了整个半乳糖残基的质子信号。根据 HSQC 谱中氢、核核磁信号的相关性(图6(a))，归属了不贡质子信号对应的碳化学位移(表 2)，并根据 HMBC 谱中(图6(b))，氢、信信号之间的长程偶合(3J)相关，对归属的质子信号进行验证，并推断半乳糖残基中的取代位点。端基质子85.02与873.5(C-6)有强 HMBC 相关信号，表明半乳聚 表2 半乳聚糖主要糖残基的化学位移数据 Table 2Chemical shifts of major galactosyl residues in synthesized galactan 半乳糖残基 化学位移/x10- H1/C1 H2/C2 H3/C3 H4/C4 H5/C5 H6/C6 H6 →6)-B-D-Galp(1→ 4.49/105.9 3.60/73.3 3.70/75.2 3.88/70.8 3.76/77.7 3.80/73.5 4.02 →4)-B-D-Galp(1→ 4.63/99.0 3.54/74.2 3.71/75.2 4.01/85.3 3.79/75.0 3.70/65.3 3.70 一2，4)-a-D-Galp(1→ 5.02/101.1 3.89/83.8 3.93/71.8 4.03/85.5 3.78/69.6 3.88/65.8 3.70 →4)-α-D-Galp(1→ 5.09/103.7 4.19/71.2 3.85/70.9 4.02/85.3 3.78/69.4 3.85/63.9 3.78 糖中存在6位羟基取代的糖残基，而往低场移动了约 8x10-的C-6化学位移，进一步表明结构中存在→6)Gal(1→结构片段。 对一维('H，1CNMR)和二维('H-'H COSY，TOCSY，HSQC 和 HMBC) 核磁图谱的综合分析，最终解析了→6)-β-D-Galp (1→，→4)-β-D-Galp(1→，一4)-α-D-Galp (1→和→2，4)-α-D-Galp(1→糖残基信号(表2)，对照半乳聚糖的相对分子质量和甲基化分析结果(表1)，表明微波辅助、磷酸催化合成的半乳聚糖结构中存在较多的→4)-D-Galp(1→和一2，4)-α-D-Galp(1→片段，推测该糖链为多分支的链状结构。 在微波辐照条件下，采用磷酸代替杂多酸能够快速、高效地催化D-半乳糖的缩合，纯化后半乳聚糖的得率为90.4%。反应生成的半乳聚糖为分支链状结构，平均聚合度为16，立体构型以α为主，新糖苷键的生成主要发生在4位、2位和6位的羟基上。通过对半乳聚糖的结构分析表明，微波辅助、磷酸催化半乳糖缩合过程中，不同位置的羟基反应活性不同，若能对目标羟基进行保护性修饰，则有可能进一步提高反应的选择性。微波辅助合成半乳聚糖结构的阐明，也为进一步研究和理解其生物活性提供了基础。 ( 参考文献： ) ( [ 1 ] CE DRIC D，TARATRA Andree F，PHILIP P E M. 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CRC Press：Taylor & Francis G roup，2005：154-155. ) 会 议 消 息 会议名称(中文)：第二糖糖合成化学青年学术研讨会 所属学科：化学生物学，生物物理学、生物化学及分子生物学 开始日期：2017-04-15 结束日期：2017-04-16 所在城市：山东省 济南市 主办单位：中国化学会 承办单位：山东大学国家糖工程技术研究中心、江西师范大学国家单糖化学合成工程技术研究中心 主题：促进创新，把握机遇 联系人：曹鸿志、孙建松 联系电话：0531-88382235、0791-88507279 E-MAIL：hzcao@sdu.edu.cn、jssun1312@163.com 通讯地址：济南市山大南路29-1号、南昌市紫阳大道99号 邮政编码：250100、330022 会议网站：http：//www.chemsoc.org.cn/meeting/home/info.asp?id=183 会议背景介绍：交流糖合成化学领域近两年的最新进展，促进糖合成化学及相关产业的健康快速发展。 食品与生物技术学报第第期 JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.No.