茶叶中总黄酮检测方案(微波合成仪)

213http：//hxya.cbpt.cnki.net化 学 研 究CHEMICAL RESEARCH2017年3月第28卷第2期 214化学研究2017年 超声波辅助提取茶叶总黄酮及抗氧化活性分析 吕名秀，高玉梅，董雪茹，强黎明，李玲玲 (河南工程学院材料与化学工程学院，河南郑州450007) 摘 要：采用超声波辅助法探讨了铁观音茶叶中总黄酮的最佳提取工艺条件，并测定了铁观音茶叶总黄酮清除羟基自由基的能力.结果表明，超声波功率400 W，料液比1：30g mL，浸提时间 30 min，乙醇浓度50%为超声波辅助提取铁观音茶叶总黄酮的最佳工艺条件，总黄酮提取率为4.74%；抗氧化实验表明随着铁观音茶叶总黄酮浓度的增大，其对羟基自由基的清除能力增大，当浓度达到 0.80 g/L，清除率为 65.14%，与 BHT相比具有较强的抗氧化能力. 关键词：茶叶；总黄酮；超声波；抗氧化活性 中图分类号： TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1008-1011(2017)02-0213-06 Study on ultrasonic-assisted extraction and antioxidantactivity of flavonoids from tea LU Mingxiu"， GAO Yumei， DONG Xueru， QIANG Liming， LI Lingling (School of Material and Chemical Engineering， Henan University of Engineering， Zhengzhou 450007， Henan， China) Abstract： Flavonoids from Tieguanyin tea were extracted by ultrasonic method， and their antioxidantactivity was determined. The results showed that the optimum extraction conditions are ultrasonic powerof 400 W， material to liquid ratio of 1 ： 30 g’mL， extracting time of 30 min， ethanol concentrationof 50%， and the extraction yield of tea flavonoids is 4.74%. With the increasing concentration of teaflavonoids， their antioxidant activity became greater. When the concentration of tea flavonoids reaches0.80 g/L， clearance rate of free radical is 65.14%. The antioxidant capacity of tea flavonoids is stron-ger than butylated hydroxytoluene (BHT). Keywords： tea；flavonoids； ultrasonic； antioxidant activity 茶叶是重要的世界性作物之一，广泛分布于亚洲远东、拉美和大洋洲等地“.它是世界上仅次于水的第二大饮品.据 FAO-IGG 统计，2015年全球茶叶产量达到528.5万吨.2010年以来，中国茶叶产量持续增长，2015年已达到227.8万吨，稳居世界第一产茶国的地位2-3.茶叶中所含的成分很多，将近500种.人们熟知的几种重要成分有茶多酚、黄酮类化合物、维生素C、咖啡碱、蛋白质等④.另外，茶叶 ( 收稿日期：20 1 6-12-29. ) ( 基金项目：河南省基省与前沿技术研究支划项目(132300410307)，河南省科技攻关项目(112102310544)，河南省教育厅自然科学研究计划项目(2011A150006、2011A150007). ) ( 作者简介：吕名秀(1982-)，女，讲师，研究方向为天然产物化学、化 学生物学.通讯 联 系 人，E-mail：rettyking@163.com. ) 中还含有许多人体必需的微量元素，如钙、铁、锌镁、碘、氟、锰、钼、硒、锗等15-6 许多文献报道，茶叶具有良好的抗氧化能力”，能抑制活性氧的形成，有效清除自由基图，这与其含有多种抗氧化物有关，如黄酮、儿茶素、茶黄素、没食子酸等.黄酮有很多的药理作用，已被广泛的应用于医学的临床治疗10-13.黄酮具有降血压、防止动脉硬化、降血脂、清热解毒、抗氧化、强化细胞膜、活化细胞等功效.随着患有肿瘤疾病人数的增多，现代医学对黄酮的需求越来越大.茶叶在全球分布广泛，且茶叶中总黄酮含量较高14.另外，市场上使用的食品抗氧化剂大多是通过化学实验合成品(如 BHT)，存在食品安全性问题.而天然抗氧化剂具有安全、无毒等优点S. ( DOI： 10.14002/j.hxya.2017.02.0131化学研究 ， 2017，28(2)：213-218 ) 以茶叶为原料，从茶叶中提取黄酮，既可满足于当代医学上、食品添加剂及化妆品对黄酮的需求，又使得茶叶得到广泛的开发利用，因此探索提取茶叶黄酮的工艺研究具有良好的经济效益和社会效益.目前，超声波提取法在天然产物中有效成分的提取上表现出较强的优势：提取速度快、提取效率高、节约溶剂、低温进行(40~60℃)、操作简单易行、提取料液杂质少等[16-18，，与传统提取法相比，超声波提取法是一种实现快速、高效、环保、节能的现代新技术.本研究将通过单因素实验和正交试验，确定超声波辅助法提取铁观音茶叶总黄酮的最佳工艺条件，同时对茶叶总黄酮进行抗氧化活性分析，为茶叶的综合开发利用提供理论依据. 材料与方法 1.1 材料与仪器 铁观音茶叶购于福建省安溪县宝隆茶业有限公司；芦丁标准品购于南京苏朗医药科技开发有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻二氮菲、七水合硫酸亚铁、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、盐酸、双氧水等均为分析纯试剂. XH-300 UL 电脑微波超声波紫外光组合催化合成仪，北京祥科技发展有限公司；CP 114 型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；UV-3600紫外可见近红外分光光度计，日本 Shimadzu 公司；DK-8AX恒温水浴槽，上海精密仪器仪表有限公司. 1.2 实验方法 1.2.1 原料处理 首先要把铁观音茶叶粉碎，通过恒温干燥箱干燥至恒重，封口密封，在干燥处保存.粉碎过40目筛、烘干至恒重，密封，在干燥处保存备用. 1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 将芦丁标准品在120℃下恒温烘干，精密称取纯度为98%的芦丁标准品10.30 mg，置于10 mL 容量瓶中，用60%乙醇溶解，然后用70%乙醇定容至刻度线，摇匀，得到芦丁标准溶液15-16，浓度1.0094g/L. 精密吸取芦丁标准溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加60%的乙醇至2.0 mL；加入5%的 NaNO，溶液0.4mL，摇匀放置6 min；然后加入10%的 Al(NO，)溶液0.4 mL，摇匀再放置6 min；再加4.0 mL 5% 的NaOH 溶液；用70%的乙醇定容，摇晃均匀后等待10min；最后在波长510 nm 处测溶液的吸光度A(见图 1).重复3次，算其平均值. 图1 芦丁标准曲线 Fig.l Standard curve of rutin 1.2.3 茶叶提取物的制备 称取干燥的茶叶粉末2.00 g，加入 60 mL 70%的乙醇于60℃水浴锅中回流提取1h，抽滤.滤液定容至100 mL，摇匀备用. 1.2.4 提取茶叶总黄酮的单因素试验 分别考察了超声波功率，浸提时间，乙醇的体积分数，料液比和温度等五个因素对超声波辅助法从茶叶中提取总黄酮的最佳工艺，每组试验重复3次，取平均值作图. 1.2.5 提取茶叶总黄酮的正交试验 通过比较每个因素对实验结果的影响，选取乙醇浓度、超声波功率、浸提时间及料液比四个因素为考察因素，以茶叶总黄酮提取率为考察指标，设计四因素三水平正交实验.根据正交试验结果得出茶叶总黄酮提取率最大的工艺条件并进行验证试验19-20，每个试验重复3次，取平均值. 1.3 总黄酮提取率的计算方法 测定提取液的吸光度121-22，具体方法同1.2.2.根据芦丁标准曲线计算茶叶总黄酮的质量浓度 p，每组试验重复3次，取平均值，计算茶叶总黄酮的提取率. 1.4 铁观音茶叶总黄酮对·OH的清除能力测定 在10 mL 容量瓶中依次加入7.5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL，50.0 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)溶液2.0 mL，7.5 mmol/L FeSO溶液1.0 mL，混匀后，再分别加入铁观音茶叶总黄酮浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L 的溶液1.0 mL，0.1%的双氧水1.0mL，用蒸馏水定容，混合均匀后，置于37℃的水浴中保温1h，在510 nm 处测得A，当用蒸馏水替代试样得到A，用蒸馏水替代H，0，和试样得到A，可排除样品本身的影响，BHT作对照，Tris-HCl 溶液作空 ( DOI： 10.14002/j.hxya.2017.02.0131化学研究 ， 2017，28(2)：213-218 ) 白溶液，计算得到自由基清除率23.每组试验重复3 次，取平均值作图. 2 结果与讨论 2.1 单因素试验结果 2.1.1超声波功率对茶叶总黄酮提取的影响 在200~500W范围内，改变超声波功率，测定茶叶总黄酮的提取率，结果见图2.茶叶总黄酮的提取率随着超声波功率的增大呈现先升后降的趋势，350 W时茶叶总黄酮提取率最高，推测可能是因为超声波功率太大，能量太高，使部分总黄酮结构遭到破坏，这样就导致检测到的总黄酮含量减少.因此，试验选择350W作为提取茶叶总黄酮的超声波功率. 图2 超声波功率对茶叶总黄酮提取率的影响 Fig.2 Effect of ultrasonic power on extractionvield of tea flavonoids 2.1.2 浸提时间对茶叶总黄酮提取的影响 由图3可以看出：延长浸提时间，茶叶总黄酮的提取率呈现先增加后减小的趋势，浸提时间为30min 时，茶叶总黄酮提取率最高.30min 前茶叶总黄酮的提取率随时间延长而增大；30 min 之后，茶叶总黄酮的提取率随时间的延长反而下降，这可能是因为时间太长，会使茶叶细胞内其他杂质进入提取液，增大传质阻力，影响茶叶总黄酮的溶出.因此，超声波辅助下，茶叶总黄酮的最佳浸提时间为 30 min. 2.1.3 乙醇浓度对茶叶总黄酮提取的影响 由图4可以得出：随着乙醇浓度的增大，茶叶总黄酮的提取率呈现先升后降的趋势，乙醇浓度为50%时，茶叶总黄酮提取效果最好.当乙醇浓度大于50%时，茶叶总黄酮的提取率下降，这可能是乙醇浓 图3 浸提时间对茶叶总黄酮提取率的影响 Fig.3 Effect of extracting time on extractionvield of tea flavonoids 度过大，茶叶中一些易溶于乙醇的脂溶性物质、色素等副产物溶出，从而减少了茶叶总黄酮的溶出量，测量结果偏低.因次，选择50%乙醇为提取茶叶总黄酮的溶剂. 图4 乙醇浓度对茶叶总黄酮提取率的影响 Fig.4 Effect of ethanol concentrationon extraction yield of tea flavonoids 2.1.4 料液比对茶叶总黄酮提取的影响 由图5可以得出：增加溶剂的体积，茶叶总黄酮的提取率呈现先升后降的趋势，料液比为1：20g·mL时，茶叶总黄酮的提取率最大.但随着溶剂体积继续增大，茶叶总黄酮的提取率减小，这也许是由于随着乙醇用量的增大，许多易溶于乙醇的其他物质大量溶出，干扰了茶叶总黄酮的溶出，从而使茶叶总黄酮的提取率降低.因此提取茶叶总黄酮的最适合的料液比是1：20 gmL. 2.1.5 温度对茶叶总黄酮提取的影响 由图6可得：升高温度，在35℃之前，茶叶总黄酮的提取率随温度升高而迅速升高，在35℃之后茶 ( DOI： 10.14002/j.hxya.2017.02.0131化学研究 ， 2017，28(2)：213-218 ) 图5 料液比对茶叶总黄酮提取率的影响 Fig.5 Effects of material to liquid ratioon extraction yield of tea flavonoids 叶总黄酮的提取率升高的较为缓慢，从节约能量和满足实验条件的方面来说，选择温度35℃恰到好处，既能满足实验所需要到的温度又减少耗能使提取茶叶总黄酮的量最多又节约了成本. 图6 浸提温度对茶叶总黄酮提取率的影响 Fig.6 Effects of ethanol temperatureon extraction yield of tea flavonoids 2.2 正交试验结果分析 为获得茶叶总黄酮最优的提取工艺，在单因素试验基础上，选择乙醇浓度、超声波功率、浸提时间及料液比作为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，按照L，(3*)正交表进行正交试验，因素水平表如表1所示，正交试验结果与数据分析见表2. 表1 正交试验因素水平数 Table 1 Factors and levels in orthogonal array design 水平 乙醇浓度 超声波功率 浸提时间 料液比 A/% B/W C/min D/(gmL) 300 1：15 2 350 1：20 3 400 40 1：25 Table 2 Orthogonal array design results 实验 编号 A B C D 提取率 /% 1 1 1 1 1 2.99 2 1 2 2 2 2.64 3 1 3 3 3 3.76 4 2 1 2 3 4.48 5 2 2 3 1 3.88 6 2 3 1 2 4.72 7 3 1 3 2 3.24 8 3 2 1 3 3.44 9 3 3 2 1 4.32 K1 3.13 3.57 3.72 3.73 K2 4.36 3.32 3.81 3.53 K3 3.67 3.97 3.63 3.89 R 1.23 0.65 0.18 0.36 因素主次 A> B> D>C 最佳方案 AB，D，C2 正交实验结果说明，不同的因素对提取率的影响是：乙醇浓度>超声波功率>料液比>浸提时间.根据结果可知，超声波辅助法提取茶叶总黄酮最佳条件是：A，B，DC，即乙醇浓度为50%，超声波功率为400W，浸提时间为30 min，茶叶与乙醇的料液比为1：30gmL. 2.3 验证实验 为确定优化提取工艺的稳定性，在该工艺条件下进行3组平行实验，测得铁观音茶叶总黄酮的提取率分别为4.72%，4.74%，4.75%，平均为4.74%，此条件为铁观音茶叶总黄酮的最佳提取工艺. 2.4 清除 ·OH 自由基能力 以 BHT 作为对照，测定了茶叶总黄酮清除羟基自由基能力，结果如图7所示.茶叶总黄酮对·OH自由基的清除能力随着总黄酮浓度的增加而增大，当浓度达到 0.8 g/L 后，清除率为 65.14%，说明茶叶总黄酮能够清除·OH自由基，且在测定浓度范围内茶叶总黄酮清除·OH自由基能力强于 BHT. 3 结论 采用超声波辅助法提取茶叶中的总黄酮具有良好的效果.单因素试验和正交试验结果显示各因素对茶叶黄铜提取率的影响顺序为：乙醇浓度>超声波功率>料液比>浸提时间.通过验证试验可知超声波辅助法提取茶叶总黄酮的最优条件为：乙醇浓度50%，超声波功率400 W，浸提时间 30 min，料液比为1：30gmL，在此条件下，茶叶总黄酮的提取 ( DOI： 10.14002/j.hxya.2017.02.0131化学研究 ， 2017，28(2)：213-218 ) 图7 茶叶总黄酮和BHT对 ·OH的清除率 Fig. 7 Scavenging effects of tea flavonoids andBHT on hydroxyl radical 率可达4.74%.茶叶总黄酮和 BHT对·OH 自由基的清除能力均随着浓度增大而变强.茶叶总黄酮能够清除·OH，且比 BHT对 ·OH的清除能力强. 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All rights reserved. http：//www.cnki.net 按语                        这篇由四川农业大学动物医学院动物疫病与人健康四川省重点实验室的研究学者完成，讨论辣木叶总黄酮响应面法微波萃取工艺优化及其体外降糖效果观察的论文，发表在重要期刊《天然产物研究与开发》上。摘要                        利用响应面法优化微波萃取辣木叶总黄酮工艺。选取乙醇浓度、微波功率、提取时间、液料比为影响因素，总黄酮得率为评价指标。在单因素实验的基础上，通过4因素3水平 Box-Behnken 中心组合试验建立黄酮得率的二次多项式回归方程，研究以上因素对总黄酮得率的影响。结果表明提取工艺条件为: 乙醇浓度 58%，微波功率 397 W，提取时间 8 min，液料比 59∶1，该条件下，总黄酮得率为3．45% ，与预期基本相符。采用HepG2 细胞研究辣木叶总黄酮体外降糖效果，检测该细胞24 h 的葡萄糖摄取量。结果表明: 在高糖环境下，辣木叶总黄酮能促进 HepG2 细胞对葡萄糖的消耗; 相同质量浓度下，经微波萃取的总黄酮降糖活性较回流提取得到的强。详情                            图1/3↑                            图2/3↑                            图3/3↑结论                            本研究采用微波萃取法提取辣木叶总黄酮，对提高辣木叶总黄酮的综合利用以及黄酮类化合物的产业化具有理论指导意义。通过响应面分析对其提取工艺进行优化，微波萃取的提取工艺为: 乙醇浓度 58%，微波功率 397 W，提取时间 8 min，液料比59∶1 ( mL /g)。在此条件下，辣木叶总黄酮得率为 3．45%。该方法传统的回流提取相比，具有耗时短，提取率高的优势。辣木叶黄酮能促进 HepG2 细胞对葡萄糖的消耗，与空白组相比具有明显降糖效果，而微波萃取得到的总黄酮比回流提取得到的总黄酮表现出更强的降糖活性。提示微波萃取法能不仅缩短提取时间，且能提高辣木叶中降糖活性成分的提取率。仪器                        准确称取样品，按试验设计的条件加入溶剂，置微波提取仪中，仪器设定为微波功率恒定模式，磁力搅拌。反应完成后滤过，即得微波萃取总黄酮( Flavones extract by Microwave Extraction，FME)。冷却至室温后取滤液 1 mL，按上法测定总黄酮浓度。