血清中普兰林肽检测方案(液质联用仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要1 Caitlin Dunning， Mary Lame， Mark Wrona，and Kim Haynes 应用优势 Waters"Oasis"肽分离技术(PST) pElutionSPE筛选方案可加快肽分析的SPE方法开发 采用MaxPeak"高性能表面(HPS)且与LC-MS兼容的QuanRecovery样品板可减少普兰林肽的非特异性结合，并使分析达到目标检测限 采用ACQUITY"MUPLC"CSH肽分析专用柱，可提高分析选择性和灵敏度，并使峰宽更窄 利用UPLC分离和Xevo"TQ-XS质谱仪可获得较高灵敏度和准确度 沃特世解决方案 Oasis WCX uElution SPE板 QuanRecovery样品板 ACQUIT Y UPLC CSH肽分析专用柱ACQUIT Y UPLC I-Class PLUS系统 Xevo TQ-XS串联四极杆 质谱仪 MassLynx"v4.2软件 TargetLynx"应用管理软件 关键词 普兰林肽， SYMLIN，肽定量分析，血清，生物分析， QuanRecoveryMaxPeak HPS样品板，固相萃取， uElution SPE， Oasis WCX，SPE， UPLC， ACQUITY CSH肽分析柱，ACQUITY UPLC I-Class PLUS， XevoTQ-XS， 非特异性结合 简介 醋酸普兰林肽 (SYMLIN")是一种人工合成的人类激素胰淀素类似物，由37个氨基酸(MW 3949.4 Da)组成(图1)。普兰林肽开发用于1型和2型糖尿病患者的辅助治疗，对于接受最理想的胰岛素治疗却仍然无法实现血糖控制的患者有改善治疗效果的作用1。普兰林肽的专利到期日愈加临近?，且最近有研究表明胰淀素在阿尔茨海默病模型中也发挥了一定作用3，因此胰淀素和胰淀素激动剂受到了越来越多的关注。普兰林肽等胰淀素激动剂具有吸收快(<30min)、代谢清除快(~1h)以及循环水平低(pg/mL)的特点，因此难以定量。得益于选择性MRM碎片离子所赋予的高灵敏度和特异性， LC-MS/MS技术在肽定量分析领域的应用越来越普遍。但针对普兰林肽等疏水性肽的方法开发和准确定量仍然极具挑战性，原因众所周知，即肽类物质存在非特异性结合(吸附)现象。这种现象可能导致回收率降低、分析物损失且难以达到检测限等问题。本文所介绍的研究采用高选择性的样品制备策略，结合具有高性能表面的LC-MS兼型型样品板，能够减少因非特异性结合而导致的普兰林肽损失。此外，本研究还将证明，采用经过优化的UPLC分离方法和色谱柱，结合高灵敏度串联四极杆质谱仪，可大幅降低定量限。利用这种分析方法萃取100uL大鼠和人血清中的普兰林肽，其LLOQ可达到25 pg/mL。 图1.普兰林肽的氨基酸序列和分子量。 实验 样品制备 样品、校准标准品和QC样品的制备 使用市售的人和大鼠血清制备不同浓度(25~50000 pg/mL)的普兰林肽(ProSpec Bio，以色列雷霍沃特，部件号： HOR-300)校准曲线标准品和质控(QC)样品。所有校准曲线标准品、QC浓度以及空白(未加标)样品均制备三份。 使用Oasis WCX uElution96孔板进行SPE净化 用100pL水稀释100pL血清，然后涡旋混合。先用200 pL甲醇对Oasis WCX pElution96孔板(部件牛：186002499)的所有孔进行活化，再用200pL水进行平衡。将稀释后的血清样品(200pL)上样至SPE板，随后依次用200pL水和200 pL 20%乙腈水溶液进行清洗。使用25pL的洗脱溶剂(75：25(v/v)乙腈：水，含1%三氟乙酸)从吸附剂上洗脱普兰林肽。将洗脱液收集到QuanRecovery样品板(部件号_186009184)中，然后用25pL水稀释，最终的样品体积为50pL。将10pL的样品进样至配备ACQUITY UPLC CSH C18， 2.1×50 mm肽分析专用柱(部件号：186006936) 和Xevo TQ-XS质谱仪的ACQUITY UPLCI-Class PLUS系统。 方法条件 进样体积： 10 pL LC梯度： 流动相A： 0.1%甲酸水溶液 时间 流速 流动相B： 0.1%甲酸的乙腈溶液 (min) (mL/min) %A %B 曲线 Initial 0.400 80.0 20.0 6 Xevo TQ-XS MS系统： 0.50 0.400 80.0 20.0 6 电离模式： ESI+ 1.00 0.400 78.0 22.0 6 毛细管电压： 1.0 kV 4.00 0.400 73.0 27.0 6 锥孔电压： 15V 4.75 0.400 5.0 95.0 6 5.50 0.400 5.0 95.0 6 离子源补偿： 30V 6.00 0.400 80.0 20.0 6 离子源温度： 150°C 7.00 0.400 80.0 20.0 6 表1.普兰林肽(包括母离子和碎片离子)的质谱分析条件。 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能量 产物离子 (m/z) (m/z) (V) (eV) 鉴定 988.36 968.11 15 20 [3H+]3/b27 初始 988.36 930.78 15 26 [4H+]4/y35 确证 结果与讨论 样品处理：具有MAXPEAK高性能表面的QUANRECOVERY样品瓶和样品板 样品接触到样品板、样品瓶或移液枪头等实验室器皿时发生的非特异性结合(NSB)或吸附，是肽等强疏水性大分子的分析中经常出现的问题4。向样品中添加载体蛋白是降低目标分子非特异性结合影响的常用策略。该步骤可以在样品净化前进行，也可以LC-MS/MS分析前进行。虽然向样品中添加载体蛋白通常有效，但也增加了样品的复杂性，与样品制备降低复杂性的目的相悖。近年来，科学家们发现了更多能够减少非特异性结合的创新方法。沃特世开发了具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery LC-MS样品板和样品瓶，该产品可减少甚至消除(在某些情况兄)肽分子与容器表面的非特异性结合。 普兰林肽是一种疏水性(HPLC指数：88.7)的大分子肽(分子量3949.4 Da)， 因此会发生一定程度的非特异性结合。在方法开发阶段，分别用QuanRecovery样品板和标准聚丙烯样品板储存普兰林肽直到进行LC-MS/MS分析， 评估两种样品板减少NSB的效果。用纯溶液制备测试样品并储存，另外，使用含载体蛋白的溶液制备样品，作为回收率100%的基准样品。评估结果表明，使用标准聚丙烯样品板时，普兰林肽的NSB程度非常高，而QuanRecovery样品板则能够大幅减少NSB的影响，如图2所示。使用QuanRecovery样品板时， 10 ng/mL普兰林肽的回收率几乎达到100%，峰面积较使用标准聚丙烯样品板储存时(回收率仅为3%)增加了约36倍。尽管该策略能够应对目标肽在分析前的NSB问题，但应始终牢记，肽分子在进入质谱仪之前可吸附至任何所接触的表面(包括所有的样品板转移步骤或系统损失)。对于所有分析物，请务必确定减少分析前的非特异性结合是否足以使分析达到目标检测限。在某些情况下，仍然需要同时添加载体蛋白和使用具有高性能表面的样品储存容器，以确保分析物不会因发生吸附而损失。得益于SPE后使用了QuanRecovery样品板和样品瓶，使得普兰林肽的分析达到了目标检测限。 图2.使用标准聚丙烯样品板和QuanRecoveryMaxPeak HPS样品板储存时， 10ng/mL普兰林肽的峰面积和回收率。 样品制备：SPE方法开发 固相萃取(SPE)是一种简单、稳定并且快速的样品制备方法，可用于萃取复杂基质中的分析物。 Oasis肽分离技术(PST) pElutionSPE筛选策略(图3，A图)专为肽分析设计，为用户提供了一种能够通过评估目标肽回收率和基质效应快速筛选多种SPE吸附剂(OasisMAX和WCX)的简便方法。利用该策略以普兰林肽为对象进行筛选，得到的起始回收率分别为46%和58%。普兰林肽的等电点(pl)计算值为10.2，表明这种肽在大多数SPE条件下均带正电。根据这一点以及初始选选实验中实现的高回收率，认为弱阳离子交换吸附剂Oasis WCX是萃取普兰林肽的最佳选择。 进行额外的优化实验表明，在上样和清洗1(5%氨水， pH约为12)步骤中，普兰林肽在WCX吸附剂上未充分保留。普兰林肽是一种碱性肽(根据pl值可得知)，在该pH条件下主要带负电，因此在带负电荷的SPE吸附剂上的保留效果较差。将预处理溶液和清洗溶液1改为水(pH<7)后，吸附剂仍带负电，但普兰林肽在上样和清洗1步骤中带正电。优化方案中的清洗2和洗脱溶液与PST方案中相同，原因是方法优化结果表明三氟乙酸能够有效地将普兰林肽从SPE吸附剂上彻底洗脱。方法优化实验还评估了甲酸和乙酸等弱酸，得到的分析物回收率均非常低(<10%)。该优化方案结合了梯度色谱分析方法(如下文所述)，使普兰林肽的回收率提高到了约75%(图3，B图)。 图3.SPE方案和结果。肽分析适用的Oasis PST SPE方案(A)，以及针对从血清中萃取普兰林肽进行了优化的Oasis WCX SPE方案(B)。 色谱分离 色谱分析是该方法成功的关键。在针对普兰林肽的方法开发过程中，评估了多种反向色谱柱的整体色谱性能(未展示)。结果表明，ACQUITY UPLC CSH C专分析专用柱因表面带正电荷而能够提供最佳的选择性和灵敏度，且信噪比较ACQUITY UPLC BEH C肽分析专用柱提高了五倍。 虽然ACQUITY UPLC CSH C肽分析专用柱能够提高选择性和灵敏度，但在提取后的血清样品中，基质干扰物仍然较多，会导致信号抑制。在方法开发阶段采用了2分钟内15%~60%流动相B(MPB)的筛选梯度。初始结果表明，相较于未经提取的普兰林肽样品，本方法存在明显的信号抑制(~20%)。修改梯度并将有机溶溶MPB的起始百分比从15%增加到20%，明显降低了进入质谱仪的基质背景。为了使极低浓度的普兰林肽从剩余的基质干扰物中得到分离，最终将梯度减缓为3分钟22%~27%的MPB。 使用高选择性色谱柱结合经过深度优化的梯度，明显降低了基质抑制作用(<10%)，使得普兰林肽的峰面积得以提高，从而大幅提升了选择性和灵敏度(图4)。 图4.筛选梯度与优化梯度。在筛选梯度和优化梯度条件下对从大鼠血清中提取的普兰林肽(100 pg/mL)进行分离得到的色谱图。优化梯度明显改善了基质抑制作用(从约20%降至10%以下)，并且使色谱基线降低至可接受水平。 质谱分析 采用Xevo TQ-XS质谱仪通过低分辨率校准(1.0 DaFWHM)对普兰林肽进行LC-MS/MS定量分析，以提高分析灵敏度。在低分辨率系统校准条件下，定量分析请务必采用高m/z的选择性MRM碎片离子，从而避免出现高背景噪音和基质效应，这一点至关重要。在方法开发阶段观察到三种主要的母离子，m/z分别为1317.48(3+)、988.36(4+)和790.89(5+)，其中4+母离子所产生的碎片离子强度最高。经手动调谐后，确认4+母离子的强碎片离子位于968.11 m/z， 对应Leu-27与Pro-28之间的b-离子断裂。本研究将此具有高选择性和高强度的普兰林肽碎片离子作为主要定量通道，将930.78m/z处的y-离子通道作为定性离子。普兰林肽定量分析优化后的MS条件和MRM通道列于表1。 线性、精密度和准确度 仅使用100pL人血清或大鼠血清即为普兰林肽的定量分析实现了出色的线性、精密度和准确度。人和大鼠血清的分析均达到了10pg/mL的检测限(LOD)和25 pg/mL的定量下限(LLOQ)。采用1/X2线性拟合时，校准曲线在25~50000pg/mL范围内呈线性(r2>0.99)(表2)。所有校准曲线和QC水平的准确度均在±15%范围内， 且CV<5%。QC定量性能如表3所示，其中所有统计数据均符合生物分析方法验证指南要求，色谱性能如图5所示。 表2.从人和大鼠血清中提取的普兰林肽的线性动态范围和标准曲线统计数据。 物种 曲线范围(pg/mL) 权重 线性拟合结果 准确度范围(%) 人 25-50，000 1/X2 0.995 91.3-111.0 大鼠 25-50，000 0.996 92.3-105.9 表3.从人血清(A)和大鼠血清(B)中提取的普兰林肽的QC定量结果。 A QC浓度 平均QC浓度计算值 平均准确度 平均%cv QC水平 (pg/mL) (pg/mL)(N=3) %(N=3) (N=3) LLOQ 25 24.0 96.1 3.5 LQC 75 77.4 103.3 5.0 MQC 2500 2619.1 104.8 1.1 HQC 40000 39309.7 98.3 2.8 QC水平 QC浓度 平均QC浓度计算值 平均准确度 平均%CV (pg/mL) (pg/mL)(N=3) %(N=3) (N=3) LLOQ 25 23.5 93.9 3.7 LQC 75 72.2 96.2 3.1 MQC 2500 2512.6 100.5 5.2 HQC 40000 36628.5 91.6 1.7 图5.使用Oasis WCX uElution SPE板从100 uL人和大鼠血清中提取的普兰林肽的空白、LLOQ和LQC色谱图。 ( 结论 ) 本文所介绍的研究利用Oasis WCX uElution SPE技术结合具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery样品板开发了一种简便的样品制备策略，将该策略与UPLC离离以及串联四极杆质谱仪联用，实现了对人和大鼠血清中普兰林肽的高灵敏度定量。 ( 使用简单的SPE技术进行样品制备，能够快速萃取出复杂基质中的普兰林肽(少于2小时) ) QuanRecovery样品板有效减少了非特异性结合，并使纯溶液中普兰林肽的峰面积增加了36倍 利用1.7 um ACQUITY UPLC CSH C1肽分析专用柱和经过优化的色谱梯度，提高了分析物的选择性并显著降低了基质效应 仅需100pL人(或大鼠)血清，I， LLOQ即可达到25 pg/mL， 并且具有出色的精密度(CV<5%)和准确度 ( 参考文献 ) ( 1. 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( Waters， T h e Science of What’s Possible， QuanRecovery， MaxPeak， A C QUITY， UPLC， Xevo， Oasis， pElution， MassLynx， 和 TargetLynx 是 沃 特世公司 的 商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 ) 利用具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery样品板开发种SPE LC-MS/MS方法 利用具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery样品板开发种SPE LC-MS/MS方法 简介醋酸普兰林肽(SYMLIN™)是一种人工合成的人类激素胰淀素类似物，由37个氨基酸(MW 3949.4 Da)组成。普兰林肽开发用于1型和2型糖尿病患者的辅助治疗，对于接受最理想的胰岛素治疗却仍然无法实现血糖控制的患者有改善治疗效果的作用。普兰林肽的专利到期日愈加临近，且最近有研究表明胰淀素在阿尔茨海默病模型中也发挥了一定作用，因此胰淀素和胰淀素激动剂受到了越来越多的关注。普兰林肽等胰淀素激动剂具有吸收快(<30 min)、代谢清除快(~1 h)以及循环水平低(pg/mL)的特点，因此难以定量。得益于选择性MRM碎片离子所赋予的高灵敏度和特异性，LC-MS/MS技术在肽定量分析领域的应用越来越普遍。但针对普兰林肽等疏水性肽的方法开发和准确定量仍然极具挑战性，原因众所周知，即肽类物质存在非特异性结合(吸附)现象。这种现象可能导致回收率降低、分析物损失且难以达到检测限等问题。本文所介绍的研究采用高选择性的样品制备策略，结合具有高性能表面的LC-MS兼容型样品板，能够减少因非特异性结合而导致的普兰林肽损失。此外，本研究还将证明，采用经过优化的UPLC分离方法和色谱柱，结合高灵敏度串联四极杆质谱仪，可大幅降低定量限。利用这种分析方法萃取100µL大鼠和人血清中的普兰林肽，其LLOQ可达到25 pg/mL。结论本文所介绍的研究利用Oasis WCX µElution SPE技术结合具有MaxPeak高性能表面的QuanRecovery样品板开发了一种简便的样品制备策略，将该策略与UPLC分离以及串联四极杆质谱仪联用，实现了对人和大鼠血清中普兰林肽的高灵敏度定量。1）使用简单的SPE技术进行样品制备，能够快速萃取出复杂基质中的普兰林肽 (少于2小时)2）QuanRecovery样品板有效减少了非特异性结合，并使纯溶液中普兰林肽的峰面积增加了36倍 3）利用1.7 µm ACQUITY UPLC CSH C18肽分析专用柱和经过优化的色谱梯度，提高了分析物的选择性并显著降低了基质效应4）仅需100 µL人(或大鼠)血清，LLOQ即可达到25 pg/mL，并且具有出色的精 密度(CV <5%)和准确度