血浆中白消安检测方案(液质联用仪)

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. |应用纪要 分析血浆样品中白消安的临床研究方法 Stephen Balloch、Lisa Calton和Gareth Hammond 沃特世公司(英国威姆斯洛) 应用优势 简介 利用色谱和高选择性的质谱检测提高分析选择性 宽的动态范围(范围拓宽200倍) 白消安是一种双功能烷基化试剂，其生物利用度受个体年龄、疾病状态和药物相互作用等因素的影响，在不同个体间差异极大'。高准确度、高灵敏度且高选择性的分析方法可在白消安的药代动力学和药效动力学研究中发挥重要作用。 样品制备过程简单、经济，仅使用极少量的样品 分析速度快 本应用纪要介绍了一种临床研究方法，使用溶于甲醇的白消安-?H，内标对血浆样品进行去蛋白处理，然后使用配备WatersTM ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱的ACQUITY UPLCI-Class系统进行色谱分离，所需时间仅2.5 min， 最后在XevoTM TQD质谱仪上进行检测(图1)。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC"I-Class系统 ACQUITY UPLC" HSS T3色谱柱主Xevo""TQD 图1. Waters ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQD系统。 MassLynx软件TargetLynx"应用管理软件 关键词白消安，UPLC-MS/MS 实验样品制备 白消安有证参比溶液及其稳定同位素内标(²H。)购自Qmx(英国艾塞克斯郡萨克斯泰德)。使用购自Golden West Biologicals(美国加利福尼亚州特曼库拉)的混合血浆作为替代基质制备校准品。白消安的校准范围为0.025~5pg/mL。使用相同的混合血浆制备浓度为0.05、0.75、1.5和3.5 pg/mL的QC样品。 样品萃取 向50pL样品中添加250pL溶于甲醇的 0.1pmol/L内标(ISTD)，旋涡混合30s， 在16100g下离心2 min。然后取50 pL上清液添加到.950pL水中配制成最终萃取物用于UPLC-MS/MS分析。 LC条件MS条件系统：配备FTN的ACQUITY UPLC I-Class系统： Xevo TQD进样针：30 pL分辨率： MS1 (0.7 FWHM)色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3MS2(0.7 FWHM)1.8 um， 2.1 mmx50 mm采集模式： 多重反应监测(MRM)(部件号186003538)(详见表2)流动相A：水+2mM醋酸铵+0.1%甲酸极性： ESI+毛细管电压： 0.5 kV流动相B：甲醇+2mM醋酸铵+0.1%甲酸离子源温度： 150°C脱溶剂气温度： 500°C洗针液：80%甲醇水溶液+0.1%甲酸驻留时间： 0.05s(白消安)，0.02s(内标)灌注溶剂：流动相A扫描间延迟时间： 0.02 s密封清洗液：20%甲醇水溶液通道间延迟时间： 0.01s柱温：35℃进样体积：10pL数据管理带TargetLynx应用管理软件的MassLynx 4.1版流速：0.60 mL/min运行时间：2.5 min方法条件(每针间隔是3 min) 梯度： 时间 %流动相A(min) %流动相B 曲线 初始 90 10 初始 0.5 90 10 1 1.5 2 98 6 2.0 2 98 11 2.01 90 10 11 分析物 母离子 子离子 锥孔电压碰撞能量 (m/z) (m/z) (V) (eV) 白消安 (定量离子) 264.0 151.1 18 12 白消安 (定性离子) 264.0 55.0 18 18 白消安-2H。 (内标) 272.0 159.1 18 12 表1.色谱洗脱时间表。 表2.本研究中所用的白消安及其内标(白消安-2H。)的MRM参数 实验结果 在上述色谱条件下，白消安与磷脂实现了色谱分离。图2是最低浓度校准品和内标的典型色谱图。 在分析白消安浓度高达10 pg/mL的血浆样品之后，未观察到系统残留污染。分析灵敏度研究结果表明，该方法可以定量分析0.020 pg/mL的白消安(RSD<20%， 偏差<15%)。 精密度评估试验设计为五天内每天萃取并定量分析四个不同浓度的QC样品(每个浓度五个重复样， n=25)。通过分析各QC水平的五个重复样评估方法的重重性。表3显示了这些实验的结果，测定四个浓度水平的白消安的总精密度和重现性为RSD≤7.3%。 图2.血浆白消安(0.025pg/mL)及其内标(白消安-2H，)的示例色谱图。 浓度 总精密度 重现性 (ug/mL) (%RSD) (%RSD) 0.05 7.3 5.1 0.75 3.9 3.6 1.5 3.3 3.2 3.5 3.2 2.7 表3.白消安分析的总精密度和重现性。 将高浓度和低浓度白消安样品按不同比例混合并进行分析，结果表明该方法在0.0175~6.51 ug/mL的范围内呈线性。 本研究评价了血浆中含有低浓度(0.05 ug/mL)和高浓度(3.5 pg/mL)白消安时的基质效应(n=6)。低浓度下的基质因子为0.92~1.06(平均值0.99)，而高浓度下的基质因子为0.99~1.12(平均值1.08)。使用白消安内标可补偿这种基质效应，得到低浓度和高浓度下的基质因子分别为0.98~1.02(平均值0.99)和0.95~1.00(平均值0.98)。 通过在高/低浓度混合血浆样品(0.05 pg/mL和3.5 ug/mL)中加入高浓度内源性化合物(白蛋白、红红素、旦固醇、甘油三酸酯和尿酸)和外源性物质脂肪乳剂(20%乳化剂)，测定白消安的回收率(n=3)。评估了这些物质可能对分析造成的干扰，所得回收率范围为85.1%~106.1%。评估对乙酰氨基酚、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、苯妥英、泊沙康唑和伏立康唑对分析的干扰作用，得到的回收率范围为93.2%~103.0%。导致回收率超出85%~115%范围的物质被视为干扰物。 采用该方法分析血浆样品中白消安的浓度与采用另一种经过验证的LC-MS/MS方法所得的结果之间具有良好的相关性， Deming回归方程为y= 1.01x+0.04(n=40， 浓度范围0.02~2.28 pg/mL， 见图3)。 图3.将一种经过验证的LC-MS/MS方法分析40份白消安样品所得的结果与沃特世方法所得的结果对比得到的Deming拟合散点图。 结论 本研究开发了一种高灵敏度、高选择性的分析血浆中白消安的临床研究方法。 此分析方法的样品制备过程快速、经济，仅使用50pL样品即可在低浓度的(0.025 ug/mL)白消安分析中达到足够的分析灵敏度，并表现出优异的精密度。 实验证明该方法具有良好的线性，而且既无系统残留又无基质效应。所得结果与一种已建立的经过验证的LC-MS/MS方法所得的结果具有良好的一致性。 此方法可用于确定浓度-时间曲线下累计面积(曲线下面积， AUC)，对于白消安的药代动力学和药效动力学研究具有重要的应用价值。 仅供研究使用。不适用于诊断。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 致谢 感谢曼彻斯特皇家医院(英国曼彻斯特)临床生物化学部门的Ed Hinchliffe为本研究提供匿名血浆样品。 ( 参考文献 ) ( 1. Savic RM， C owan MJ， Dvorak CC， Sung-Yun Pai MD， Pereira L， Bartelink IH， Boelens JJ， Bredius RGM， Wynn RF， Cuvelier GDE， Shaw PJ，Slatter MA， and Long-Boyle J R . Effect of Weight and Maturation on Busulfan Clearance in Infants and Small Children Undergoing H e matopoietic Cell Transplantation.Biol Blood Marrow Transplant. Nov 2013；19(11). ) 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800 (400)8202676www.waters.com 分析血浆样品中白消安的临床研究方法 分析血浆样品中白消安的临床研究方法 简介白消安是一种双功能烷基化试剂，其生物利用度受个体年龄、疾病状态和药 物相互作用等因素的影响，在不同个体间差异极大1。高准确度、高灵敏度且 高选择性的分析方法可在白消安的药代动力学和药效动力学研究中发挥重要 作用。 本应用纪要介绍了一种临床研究方法，使用溶于甲醇的白消安-2H8内标对血浆 样品进行去蛋白处理，然后使用配备WatersTM ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱 柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，所需时间仅2.5 min，最后在 XevoTM TQD质谱仪上进行检测。结论本研究开发了一种高灵敏度、高选择性的分析血浆中白消安的临床研究方法。此分析方法的样品制备过程快速、经济，仅使用50 µL样品即可在低浓度的 (0.025 µg/mL)白消安分析中达到足够的分析灵敏度，并表现出优异的精密度。实验证明该方法具有良好的线性，而且既无系统残留又无基质效应。所得结 果与一种已建立的经过验证的LC-MS/MS方法所得的结果具有良好的一致性。此方法可用于确定浓度-时间曲线下累计面积(曲线下面积，AUC)，对于白消 安的药代动力学和药效动力学研究具有重要的应用价值。