单克隆抗体 IgG1中电荷异质性检测方案(液相色谱仪)

采用 Agilent Bio MAb NP5 色谱柱分析完整和羧基末端消解的 IgG1 应用简报 生物制药 作者 摘要 Xiaomi Xu 和 Phu T Duong 几乎所有蛋白质在 mRNA 翻译完成后都要经历修饰过程，而此类修饰很可能表现为重链安捷伦科技有限公司 羧基末端赖氨酸的存在或缺失。因此，监测单克隆抗体，特别是 lgG1 产品的一致性有着重要意义。安捷伦 Bio Mab 色谱柱专门设计用于单克隆抗体的电荷异质性(包含羧基末端赖氨酸变异)分析。Agilent Bio MAb NP5(非多孔型， 5 pm) 4.6×250mm PEEK色谱柱能够实现更高的分离度，同时能够改善峰形、提高定量准确度。将该型色谱柱安装于两种不同的高效液相色谱 (Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱和 Agilent1100系列液相色谱)系统中，对两种不同来源的 IgG1 进行分析。 Agilent Technologies 过去的十年中，单克隆抗体/IgG1 (mAb) 作为一种重要的生物治疗药物逐渐被大家所认知。然而由而其结构较为复杂， IgG1常常表现为高度的异质性，这种异质性包含了各种各样的翻译后修饰。其中，比较常见的是治疗性抗体重链上羧基末端不同水平的赖氨酸修饰。虽然尚未完全掌握此类修饰对 lgG1 生物活性的影响，但是羧基末端赖氨酸变体异质性的程度能够反映产品的一致性，因此有必要对其进行评估。阳离子交换色谱法是表征 IgG1 电荷异质性的有效手段， Agilent Bio MAb NP5 具有良好的选择性，可以获得极高的分离度，特别适合 lgG1分析。 实验部分 样品采用了两种不同来源的、皆为人源化的中国仓鼠卵巢细胞提取的单克隆抗体 IgG1。羧肽酶 B， NaCl， NaH，PO ， Na，HPO均购自西格玛奥德里奇(美国密苏里州圣路易斯)。 羧基末端酶切步骤 lgG1， 1 mg/mL溶于10mM pH 7.5磷酸钠盐缓冲液，以12.5个单位羧肽酶B于37℃条件下孵育 2h。 结果与讨论 羧肽酶B是一种可以水解蛋白质羧基末端碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)的酶。通过比较完整和羧基末端酶解 IgG1的色谱图，可以鉴定 IgG1链上羧基末端赖氨酸的连接情况。图1中所示为采用 Agilent Bio MAb NP5色谱柱得到的完整和羧基酶解后 lgG1(来源A)的叠加色谱图，上图是完整的色谱图，下图是上图椭圆形区域的放大图。大约在2min 时最先流出羧肽酶B。从色谱图中可以看出，来源A的IgG1 含有四个碱性变体，其中有两个峰为赖氨酸变体 (lys-1， Iys-2)。 图 1.采用 Agilent Bio MAb NP5 色谱柱分离完整和羧基末端消解的 lgG1 (来源A)， 梯度： 0-25min， 10-35%B 图2是来源B的IgG1 完整和酶解后色谱图，从图中可以看出，IgG1 含有两个碱性变体，而这两个碱性变体都来源于赖氨酸(lys-1，lys-2)。通过比较消解后的 IgG1色谱峰，很容易观察到这两个宽峰含有赖氨酸变体的信息。 图 2.采用 Agilent Bio MAb NP5 色谱柱分离完整和羧基末端消解的 lgG1 (来源B) 由于分离度较高，可以计算来源A 中变体 lys-1和 lys-2的峰面积(图3)，其面积分别为272和148，各占总面积的约8.64%和1.34%。通过重复10 次 lgG1(来源A)进样测试该分析方法 的重现性。测试结果表明保留时间、峰形、峰面积具有高度的一致性。同时，也对来源B羧基末端峰的计算数据进行了分析(数据未示出)。 图 3.在 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统上使用 Agilent Bio MAb NP5 色谱柱分析羧基末端消解的 IgG1(来源A)的计算数据 在Agilent 1100 系列液相色谱仪上重复相同的试验，图4是采用Agilent Bio MAb NP5， 4.6×250 mm 色谱柱分析完整(上图)和羧基末端消解(下图)的IgG1(来源A)所得到的色谱图。很显然，正如之前的报道[1]， Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统(B栏，右侧)可以实现更好的峰形和更高的灵敏度。 ( 参考文献 ) 1.P. T. Duong， F. Ahmed， T. Clary. “HPLC分离单克隆抗体的电荷变异体：使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统对比 Agilent Bio Mab NP10 和竞争产品 10 pm 粒径 WCX色谱柱”。应用简报，安捷伦科技有限公司，出版号5990-6844CHCN(2010)。 结论 更多信息 Agilent Bio MAb NP5， 4.6x250 mm 色谱柱用于 Agilent 1260Infinity 生物元性四元液相色谱系统时，可以实现对lgG1 单克隆抗体的高分离度分析。两种不同来源 lgG1的分离结果和赖氨酸变体百分比也各不相同。虽然两种 IgG1都来源于中国仓鼠卵巢细胞系，但不同的生产工艺导致两种 lgG1 中的赖氨酸含量不同。 这些数据代表了典型的分析结果。如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn. Agilent 1100 系列液相色谱系统 Agilent 1260 生物惰性四元液相色谱系统 图4.分别在 Agilent 1100 系列液相色谱和 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统上，使用 Agilent Bio Mab NP5 PEEK色谱柱，对来源A的完整和羧基末端酶解 IgG1 进行分离的结果对比 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料中可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 C 安捷伦科技有限公司，2012 2012年8月6日，中国印刷 5991-0895CHCN Agilent Technologies 几乎所有蛋白质在mRNA 翻译完成后都要经历修饰过程，而此类修饰很可能表现为重链羧基末端赖氨酸的存在或缺失。因此，监测单克隆抗体，特别是IgG1 产品的一致性有着重要意义。安捷伦Bio Mab 色谱柱专门设计用于单克隆抗体的电荷异质性（包含羧基末端赖氨酸变异）分析。Agilent Bio MAb NP5（非多孔型，5 μm）4.6 × 250 mm PEEK 色谱柱能够实现更高的分离度，同时能够改善峰形、提高定量准确度。将该型色谱柱安装于两种不同的高效液相色谱（Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱和Agilent 1100 系列液相色谱）系统中，对两种不同来源的IgG1 进行分析。