鱼体组织中溴化阻燃剂 (BFR)检测方案(气相色谱仪)

使用经优化的提取/净化方法以及安捷伦7000三重四极杆气质联用系统测定鱼体组织中的溴化阻燃剂 (BFR) 作者 Kamila Kalachova、Jana Pulkrabova、Tomas Cajka 和 Jana Hajslova 布拉格 化学技术学院 摘要食品分析与营养系 Technicka 3166 28 Prague 6Czech Republic Chris Sandy 安捷伦科技(英国)有限公司 610Wharfedale Road Winnersh Triangle Wokingham Berkshire RG41 5TP UK 本应用简报对一种可用于同时定性、定量分析鱼体肌肉组织中的多溴联苯醚(PBDE) 和不同类型的替代溴化阻燃剂 (ABFR)的高通量、高灵敏、低成本分析方法进行开发与验证。定量步骤前的样品处理可大为简化，具体如下：在向匀化的样品中加入水后，疏水性分析物在外加的无机盐作用下转化为乙酸乙酯。然后，在硅胶微柱上清除包含分配所得的有机粗提物中的大量脂肪。最后，通过与串联质谱联用的气相色谱法 (GC/MS/MS)以多反应监测(MRM)模式在 Agilent 7890 气相色谱与 Agilent 7000B 三重四极杆 GC/MS系统上分析鱼体组织提取物。 已有证据表明，食用鱼肉尤其是富含脂肪酸的鱼肉(例如三文鱼，通常含有ω-3多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸 (EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)) 对心血管系统有益，并适于作为明显性冠心病的二级预防。但相反的是，这使得膳食接触某些污染物例如溴化阻燃剂(BFR)的风险增加。因此，从2004年8月起欧盟(EU) 市场禁止了销售含有高于 0.1%五溴联苯醚 (pentaBDE)和八溴联苯醚 (octaBDE)技术混合物的食品，在2008年7月，该禁令又进一步延伸至含有十溴联苯醚 (decaBDE)的电气与电子产品[1.2]。由于这些立法的出台，市场上推出了适合作为多溴联苯醚替代品用于商业用途的替代性BFR。它们中的一些化合物例如1，2-双(2，4，6-三溴苯氧基)乙烷 (BTBPE) 已经在环境中被检出[3]。因此，需要一种简便、快速、低成本、高灵敏的分析方法，能够在短时 间内收集大量可靠的数据，以帮助控制食品污染并确保对食品和饲料快速预警系统 (Rapid Alert System for Food and Feed， RASFF)的灵活响应[4]。 实验部分 标准品和溶液 在异辛烷中配制包含以下物质的校准溶液： BDE 28-203、HBB、PBT、PBEB 和BTBPE，系列浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100和500 ng/mL； BDE 206、207、209和OBIND，系列浓度为0.25、0.5、1、5、10、50、100、500和1，000 ng/mL。每个校准点以及样品提取物的异辛烷溶液均含有替代标准品 BDE37以及注射标准品 BDE77 和13C-BDE 209，它们的浓度分别为10、5和50 ng/mL。 缩写 分析物 CAS 号 BDE 28 2，4，4'-三溴联苯醚 41318-75-6 BDE 37 (SUR) 3，4，4'-三溴联苯醚 147217-81-0 BDE 47 2，2'，4，4'-四溴联苯醚 5436-43-1 BDE 49 2，2'，4，5'-四溴联苯醚 243982-82-3 BDE 66 2，3'，4，4'-四溴联苯醚 189084-61-5 BDE 77 (SS) 3.3'，4，4'-四溴联苯醚 93703-48-1 BDE 85 2，2'，3，4，4'-五溴联苯醚 182346-21-0 BDE 99 2，2'，4，4'，5-五溴联苯醚 60348-60-9 BDE 100 2，2'，4，4'，6-五溴联苯醚 189084-64-8 BDE 153 2，2'，4，4'5，5-六溴联苯醚 68631-49-2 BDE 154 2，2'，4，4'5，6'-六溴联苯醚 207122-15-4 BDE 183 2，2'，3，4，4'，5'，6-七溴联苯醚 207122-16-5 BDE 196 2，2'，3，3'，4，4'，6，6'-八溴联苯醚 N/A BDE 197 2，2'，3，3'，4，4'，6，6'-八溴联苯醚 N/A BDE 203 2，2'，3，4，4'，5，5'，6-八溴联苯醚 N/A BDE 206 2，2'，3，3'，4，4，5，5'，6-九溴联苯醚 N/A BDE 207 2，2'，3，3'，4，4，5，6，6'-九溴联苯醚 N/A BDE 209 十溴联苯醚 1163-19-5 13C-BDE 209 (SS) 13C-十溴联苯醚 N/A BTBPE 1，2-双(2，4，6-三溴苯氧基)乙烷 37853-59-1 HBB 六溴苯 87-82-1 PBEB 五溴乙苯 85-22-3 PBT 五溴甲苯 87-83-2 OBIND 八溴三甲基苯基茚满 N/A 化学品和材料 ·己烷(德国默克 SupraSolv级，或同等质量) ·异辛辛(德国默克 SupraSolv级， 或同等质量) ·乙酸乙酯(德国西格玛奥德里奇气相残留分析级，或同等质量) 二氯甲烷(德国默克SupraSolv级，或同等质量) ·无水硫酸钠(捷克Penta Chrudim，或同等质量) 将无水硫酸钠在600°℃下加热7h，储存在干燥器中备用。以此方式制备和储存的硫酸钠有效期为一个月。 ·硅胶 (0.063-0.200mm)(德国默克，或同等质量) 将硅胶在180℃下加热活化5h，然后通过添加2%的去离子水并振摇3h而失活，再储存于干燥器中16h备用。以此方式制备和储存的硅胶有效期为14天。 .硫酸镁(德国西格玛奥德里奇，或同等质量) ·氯化钠(捷克 Lach-ner， 或同等质量) ·玻璃棉(德国默克，或同等质量) ·50mL聚丙烯管 (法国Merci， 或司等质量) ·230mm 长玻璃巴氏移液管 D812(德国 Poulten and GrafGmbH， 或同等质量) 仪器 .组织研磨机，购自莱驰公司(德国Haan) ·带水浴的真空旋转蒸发仪 Buchi Rotavapor R-114 和R-200(瑞士步琪旋转蒸发仪) . 离心机 Rotina 35R (德国海蒂诗离心机) 样品前处理 将10g鱼体组织织浆(含替代标准品BDE 37-10 ng 溶质)置于聚丙烯离心管中，加5mL蒸馏水混匀，然后加10mL乙酸乙酯剧烈振摇1 min。随后，将4g硫酸镁和2g氯化钠加入混合物中。 继续振摇1 min， 离心 (5 min， 11000 rpm)，然后从有机层取出5mL等分试样。在缓和的干燥氮气流下小心蒸干溶剂。 将蒸发后的提取物用1mL正己烷重新溶解，再用手工制备的硅胶微柱纯化。根据鱼体肌肉脂肪含量进行脂肪测定和硅胶微柱尺寸选择在别处有所描述[5]。将收集的洗脱液用真空旋转蒸发仪小心蒸发，再将残余的溶剂在缓和的干燥氮气流下挥去。将残渣重新溶于0.5mL异辛烷，异辛烷中含有用作注射标准品的 BDE 77(5 ng/mL) 和 13C BDE 209 (50 ng/mL)。 图1. 新鲜鱼体肌肉组织提取与净化的总体方案 (Hex-正己烷， DCM-二氯甲烷， Et0Ac-乙酸乙酯) 仪器分析 所有气质联用实验均在 Agilent 7890A 气相色谱仪(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司)和电子电离(EI)模式的Agilent 7000B三重四极杆质谱仪(安捷伦科技公司)上运行。气相色谱系统配有 Agilent 7693A 自动进样器(安捷伦科技公司)和二氧化碳冷却的多模式进样口(MMI)。为了进行分离，采用了DB-XLB毛细管柱(15mx0.18 mm， 0.07 um 膜厚；安捷伦科技公司)。经优化的气相色谱分析条件列于表2。 色谱柱 15mx0.18 mm， 0.07 pm DB-XLB (定制色谱柱， 无部件号) 自动进样器 Agilent 7693A 自动液体进样器 进样 2 pL冷不分流进样，采用二氧化碳冷却多模式进 样口(MMI) 进样口衬管 2 mm内径凹口去活衬管(部件号5190-2296) 进样器温度程序 80°C(0.20 min)， 以600 °C/min 升至285℃ 进样模式 冷脉冲不分流 进样脉冲压力 50 psi 不分流时段 1.5 min 到分流口的吹扫流速 1.0 min 时 50 mL/min 载气 氦气 载气流速 1.5mL/min (11 min)， 以15 mL/min 升至 3mL/min 柱温箱程序 110℃ (1.5 min)， 以 30°C/min 升至320°℃ (3.5 min) 运行时间 12min 化合物名称 前体离子 一级质谱分辨率 产物离子 BDE 28 405.8 宽 246 宽 20 0.3 10 407.8 宽 248.1 宽 22 0.3 10 PBT 406.7 宽 325.8 宽 16 0.3 10 406.7 宽 246.8 宽 24 0.3 10 PBEB 499.7 宽 484.6 宽 19 0.3 10 499.7 宽 420.5 宽 11 0.3 10 BDE 37 405.8 宽 246.0 宽 20 0.3 10 407.8 宽 248.1 宽 22 0.3 10 BDE 49 485.7 宽 326.1 宽 28 0.3 10 483.7 宽 324.1 宽 32 0.3 10 HBB 551.7 宽 472.5 宽 26 0.3 10 551.7 宽 391.5 宽 34 0.3 10 BDE 47 485.7 宽 326.0 宽 28 0.3 10 483.7 宽 324.1 宽 32 0.3 10 BDE 66 485.7 宽 326.0 宽 28 0.3 10 483.7 宽 324.1 宽 32 0.3 10 BDE 77 485.7 宽 326.0 宽 28 0.3 10 403.8 宽 269.9 宽 35 0.3 10 表3. MS/MS 方法的优化条件(续) 结果与讨论 利用新开发的高通量样品前处理方法法将7890气相色谱仪和7000B三重四杆杆质质联用系统作为仪器分析方法，可以分析21种代表性的BFR。除了由欧洲食品安全局食物链污染物科学专家组 (EFSA CONTAM panel)[6.7] 包括在 BFR 核心监测组中的8种主要关注的 PBDE 同类物 (BDE 28、47、99、100、153、154、183和209)外，我们还测定了另外8种 PBDE同类物(BDE 49、66、85、96、197、203、206和207)以及5种替代性BFR (PBEB、PBT、HBB、BTBPE 和 OBIND)。 色谱分离 当分析 PBDE时，不仅需要考虑目标分析物的分离，还必须考虑与其他非目标化合物的潜在共流出，因为许多同分异构体可能出现在实际样品中。由于这些原因，通常使用30m 长的毛细管柱。然而，当必须分析高度溴化的热降解性化合物例如 BDE 209 时，通常需要采用较短(10-15m)的色谱柱。因此，在这种情况下共 流出的问题可能会出现。此止，采用负化学电学源(NCI)检测溴同位素模式(m/z 79 和81)时，其他溴化物可能易于产生干扰。相反，El则会产生特异性更高的[M]+和[M-Br，]+离子，同时13C标记的标准物质可有利于准确定量，量相比 NCI 定量限通常会高一些 如图2和图3所示，采用以下条件所有21种目标 BFR均在12分钟内得到分离，而相比之下，使用单四极杆 NCI模式的气相色谱运行则需要 17.5 min： 7890气相色谱和7000B三重四及杆系统，Agilent DB-XLB 毛细管柱(15mx0.18 mm， 0.07 pm)， El模式。仪器分析所需的时间得以缩短源于 DB-XLB柱和 EI-MRM 运行模式下的三重四极杆质谱仪的高分离效率，在这情况下，可以使用高选择性前体离子和产物离子将 PBDE 与其他溴化物分离。如图2所见， PBEB 和BDE 37 的共流出物可以通过使用不同的 MS/MS(EI) 离子对而轻易地分离。然而，当使用 GC/MS (NCI) 系统时则无法分离 BDE 28和 PBT的共流出物(图4)。 图2. 5pg/kg 加标的鱼体肌肉组织的色谱图 (GC-EI-MS/MS) 示例 图3. 自然情况下污染的鱼体肌肉组织的色谱图(GC-EI-MS/MS) 示例 方法性能特性 利用最终的 GC/MS/MS设置，将溶于异辛烷的所有目标化合物的混标用来测试仪器分析的重现性，混标浓度为100 ng/mL (相当于10 pg/kg鱼体肌肉组织)。GC/MS/MS对所有目标化合物的响应的重现性用相对标准偏差(RSD，%) 表示， 范围为 1%-7%。 我们在验证研究中评价了详细列于本应用简报“实验部分”章节中的样品前处理方法和优化的 GC/MS/MS分析条件，验证数据 的概览(系统回收率、重现性、定量限(LOQ)和线性)见表4。为了验证整个分析方法，将鱼体肌肉组织的样品添加两种浓度水平(1和5pg/kg) 的所有目标分析物标准物质，然后进行处理和分析。对于每批样品，均配制了程序空白样(即，以相同方式处理但不使用试验基质的样品)。回收率(%)计算为绝对回收率(不根据替代标准品的回收率进行修正)，而重现性(%)则表示为相对标准偏差 (RSD)。回收率 (%)和RSD (%)的范围分别为 78%-115%和2%-14%。 基于低浓度污染物的基质样品的 GC/MS/MS初步测定结果，鱼体肌肉组织的定量限为 0.005 pg/kg， 相当于0.05 ng/mL (高度溴化的 BFR 会得到更高的值)。 鉴于新鲜鱼体组织中目标分析物存在的宽浓度范围，有必要使用更宽的工作标准溶液校准浓度 0.05-500 ng/mL (就 BDE 206、 207、209和 OBIND 而言为0.25-1000 ng/mL)。使用加权线性回归(1/x)，计算校准曲线的回归系数(R2)，校准曲线的浓度范围为定量限直至最高校准点 (500 ng/mL 或 1000 ng/mL)。在这些实验中，所有目标分析物均满足上述校准范围内的线性，回归系数(R2)高于0.99。 表4. 对样品前处理方法和经优化的 GC/MS/MS 分析进行验证研究获得的验证数据概览 分析物 1 pg/kg 5 pg/kg 回收率(%) RSD (%) REC (%) RSD (%) (pg/kg) (R2)* BDE 28 89 2 92 6 0.005 0.9990 BDE 47 78 7 83 5 0.005 0.9983 BDE 49 6 97 4 0.005 0.9993 BDE 66 6 96 5 0.005 0.9989 BDE 85 7 106 0.005 0.9984 BDE 99 8 100 5 0.005 0.9982 BDE 100 8 98 5 0.005 0.9981 BDE 153 107 10 101 7 0.05 0.9985 BDE 154 99 10 93 0.005 0.9984 BDE 183 100 8 104 10 0.05 0.9936 BDE 196 83 14 81 0.1 0.9964 BDE 197 86 12 93 12 0.1 0.9990 BDE 203 79 12 81 12 0.1 0.9929 BDE 206 79 10 86 13 0.9987 BDE 207 85 12 89 14 0.5 0.9963 BDE 209 81 8 79 11 0.9985 PBT 10 114 5 0.05 0.9994 PBEB 7 4 0.01 0.9959 HBB 12 3 0.05 0.9969 BTBPE 113 13 12 0.01 0.9973 OBIND 104 11 10 0.9929 *计算了从定量限直至最高校准点(500 ng/mL=50pg/kg，以及就 BDE 206、207、209和 OBIND 而言1000 ng/mL=100 pg/kg) 范围内的校准曲线的回归系数(R2) 基于乙酸乙酯-水性样品悬浮液分配然后进行 SPE 硅胶微柱净化而新开发的方法可显著提高实验室效率；相对于索氏提取，因为之后还需要接着采用其他常规净化技术进行几个小时，而该方法可在不到1个小时内处理多达6个样品。另外，当使用这种新的样品处理方法时，提取溶剂的用量也得以明显减少，因此该方法不仅可以降低成本还能提供更环保的分析方式。 在本应用简报“实验部分”章节中详述的样品前处理方法性能特性以及优化的 GC/MS/MS分析条件与 SANCO 文件号12495/2011[8]中所述一致，其最初设计是针对农残分析，但通常也适用于其他有机食品污染物的分析(回收率范围70%-120%，重现性小于20%)。所有目标分析物的回收率范围为 78%-115%，重现性(以相对标准偏差表示， RSD)不超过14%， 甚至在较低的加标水平下也是如此。在优化的 GC/MS/MS (EI) 条件下，定量限为 0.005 ug/kg (高度溴化的 BFR会得到更高的值)。 三重四极杆质谱El模式是常规单四极杆质谱不错的替代之选，因为可以选择高 m/z 区域的前体离子和产物离子，从而使干扰更少、灵敏度更高。使用该方法，甚至对于痕量水平的 BFR分析(在探索研究中进行可靠的数据评估所必需)也是可行的。有关该应用进一步的详细信息也可参考最近发表的期刊论文[9]。 ( 参考文献 ) ( 1. EC： Directive 2003/11/EC of 6 February 2003 amending for the 24th time Council Directive 76/769/EEC relating to restrictions on the marketing and use o f certain dan- gerous substances and preparations (pentabro- modiphenyl ether， octabromodiphenyl et h er). ) ( 2. BSEF. Bromine Science and E n vironmental Forum； 2012. http：//www.bsef.com (accessed June 26，2012). ) ( 3. A. Covaci， S. H arrad， M . A.-E. Abdallah， N. Ali ， R. J. La w ， D. Herzke. C ， A. de Wit， Environ. Int. 37 (2011)， 532-556. ) ( 4. Rapid Alert System for Food a nd Feed，http：//ec.europa.eu/food/food/rapidalert/index en.htm (accessed June 26， 2012). ) ( 5. K. Kalachova， J . Pulkrabova， L.Drabova， T. Cajka， V. Kocourek， J. Hajslova， Anal. Chim. Acta. 707 (2011)， 84-91. ) 6. 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Pulkrabova， Talanta 105 (2013)， 109-116. 更多信息 有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站：www.agilent.com/chem/cn. www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @ 安捷伦科技(中国)有限公司，2013 ( 中国印制 ) 2013年1月7日 5991-0887CHCN Agilent Technologies 本应用简报对一种可用于同时定性、定量分析鱼体肌肉组织中的多溴联苯醚(PBDE) 和不同类型的替代溴化阻燃剂(ABFR) 的高通量、高灵敏、低成本分析方法进行开发与验证。定量步骤前的样品处理可大为简化，具体如下：在向匀化的样品中加入水后，疏水性分析物在外加的无机盐作用下转化为乙酸乙酯。然后，在硅胶微柱上清除包含分配所得的有机粗提物中的大量脂肪。最后，通过与串联质谱联用的气相色谱法(GC/MS/MS) 以多反应监测(MRM) 模式在Agilent 7890 气相色谱与Agilent 7000B 三重四极杆GC/MS 系统上分析鱼体组织提取物。