鸡蛋和鸡肉中利巴韦林与金刚烷胺检测方案(液相色谱仪)

谢继安安徽省疾病预防控制中心 张聪聪、吴翠玲、李建中 采用固相萃取结合液质联用系统同时分析鸡蛋和鸡肉中的利巴韦林与金刚烷胺 前言 利巴韦林和金刚烷胺属于抗病毒药物，在人类流感类疾病防治领域应用广泛。但有些违规养殖户会将其非法用于畜禽疫病防治，如此长期大量使用很容易诱导流感病毒变异，为动物疫病甚至人类流感类疫病的防治带来不确定性。此外，动物源食品中这些药物的残留不仅会造成食品风味和品质的下降，还会通过食物链进入人体，长期累积后会产生神经毒性，并直接诱导人类流感病毒产生变异及耐药性增强，从而威胁人类健康。因此，美国FDA 和我国农业部都将这两个药物列入兽药禁止使用的范畴。这两个药物虽然已被禁用作兽药，但实际上还存在非法使用的现象，2012年爆发的“速生鸡”事件，就是曝光了某些饲养企业在养鸡时使用了这两种抗病毒药物。 本文建立了一种用于鸡肉、鸡蛋中利巴韦林和金刚烷胺同时分析的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法。 对样品进行前处理。里取样品2±0.01 g， 置50mL离心管中，加入40 pL 混合内标溶液(D1s-金刚烷胺：200 pg/L，13Cg-利巴韦林：1000pg/L)，再加入5 mL 0.5 mmol/L 乙酸铵溶液 (pH 4.8)和40 pL 0.25 U/pL酸性磷酸酶溶液(购于 Sigma公司)，涡旋30秒，置于摇床上，37℃恒温避光酶解2小时。 在酶解液中加入4 mL 5%三氯乙酸溶液，涡旋30秒，10000 r/min低温离心10分钟，移取上清液于另一离心管中，用5%氨水调pH至8.5±0.1，加水定容至10mL， 再次离心，得到上层澄清提取液。 取5mL样品提取液经 Agilent Bond Elut PBA/PCX 复合固相萃取柱富集和净化后，使用配备Agilent Poroshell 120 SB-Aq色谱柱的Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统/6470三重四极杆液质联用系统对目标物进行分析，图1为固相萃取操作流程，表1-3为液相色谱、质谱分析条件。 图1.固相萃取操作流程图 表 1.液相色普条件 液相色谱 1290 Infinity 液相色谱系统 色谱柱 Poroshell 120 SB-Aq， 2.1×100m， 2.7pm(部件号685775-914) 流速 0.4 mL/min 柱温 35°C 进样量 5pL 流动相A 0.1%甲酸、0.5 mmol/L 乙酸铵的水溶液 流动相B 乙腈 时间 (min) B (%) 0 0 2.0 0 洗脱程序 4.0 12 5.0 12 5.01 98 9.0 98 9.1 0 后运行 3 min 表2.质谱条件 质谱 6470三重四极杆液质联用系统 离子源 ESI+ 监测方式 MRM 喷嘴电压 0V 毛细管电压 3000V 雾化气压力 35 psi 鞘气温度 275°C 鞘气流量 10 mL/min 干燥气温度 250°C 干燥气流量 7 mL/min 表3.目标物 MRM参数 化合物名称 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碎裂电压(V) 碰撞能量(eV) 13C-利巴韦林 250.1 113 70 5 Dg-金刚烷胺 167.2 150.1 100 20 利巴韦林 245.1 11396 7070 5 30 金刚烷胺 152.2 135 93 100 100 18 30 如图2至图6所示，本方法适合于鸡肉和鸡蛋中利巴韦林和金刚烷胺残留的检测。方法中利巴韦林和金刚烷胺的定量限分别为0.08 ng/g 和0.03 ng/g，分别在 0.1-1000 ng/mL 和 0.02-50 ng/mL范围内线性相关良好。如表4、表5所示，利巴韦林和金刚烷胺分别在 1.5-15 ng/mL 和 0.3-3 ng/mL 加标浓度下，在不同基质中的平均回收率分别为 94.26%-108.50%和86.66%-111.90%，RSD 均小于等于3.75(n=3)。由图7可以看出用 Bond Elut PBA/PCX 同时萃取和净化利巴韦林，鸡蛋的基质效应较小，而对于鸡肉，虽然基质效应相对较为明显，但基质加标样品与溶剂加标样品的响应比例也是大于50%以上的，通过内标校准后仍然可以保证很好的回收率结果，满足检测方法的需求。 图2.利巴韦林标准溶液(蓝色)、鸡肉空白样品(绿色)、鸡肉加标样品(红色)的叠加谱图 图3.利巴韦林标准溶液(蓝色)、鸡蛋空白样品(绿色)、鸡蛋加标样品(红色)的叠加谱图 图4.金刚胺标准溶液(蓝色)、鸡肉空白样品(绿色)、鸡肉加标样品(红色)的叠加谱图 图5.金刚烷胺标准溶液(蓝色)、鸡蛋空白样品(绿录)、鸡蛋加标样品(红色)的叠加谱图 图6.利巴韦林(上)和金刚烷胺(下)的标准曲线 图7.利巴韦林和金刚烷胺的基质效应 表4.利巴韦林空白样品加标回收率 基质种类 加标浓度 ng/mL 回收率 (%) RSD 值 (n=3) 鸡肉 1.5 108.50 2.26 5 94.67 3.26 15 94.90 2.68 鸡蛋 1.5 96.21 2.50 5 94.26 1.78 15 96.73 0.09 表5.金刚烷胺空白样品加标回收率 基质种类 加标浓度 ng/mL 回收率 (%) RSD 值 (n=3) 鸡肉 0.3 94.71 2.94 1.0 86.66 2.19 3.0 92.12 3.75 鸡蛋 0.3 105.1 3.47 1.0 96.78 1.06 3.0 111.9 2.64 本文所采用的 Bond Elut PBA/PCX 固相萃取柱是含苯硼酸官能团的独特硅胶基质吸附剂 PBA 和混合式强阳离子交换吸附剂 PlexaPCX的复合柱，可同时有效地保留和净化样品中的利巴韦林和金刚烷胺。 PBA 可以同时保留酶解后游离出的核苷酸和利巴韦林，而在酸性洗脱条件下，利巴韦林被洗脱下来，而核苷酸在被洗脱后重新以阳离子交换机理保留 PCX填料层；金刚烷胺在开始时以反相机理被保留在 PBA 或者 PCX 料料上，在酸性条件下洗脱利巴韦林时则在 PCX 填料层转换为阳离子交换机理进行保留，从而能够使用甲醇淋洗去除更多非极性保留杂质。整个前处理方法不但保证了更加干净的净化效果，同时也大大缩短了样品前处理时间。检测时，配合 Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱对目标化合物进行分析， Poroshell 120 SB-Aq 色谱柱采用薄壳型极性修饰反相固定相 SB-Aq，可以耐100%的纯水相，使色谱柱在低pH条件下使用时也有较长的寿命，同时可实现对目标物的快速分离分析。 Agilent Bond Elut PBA/PCX 固相萃取柱，200 mg/60 mg，3mL，部件号12105033 ( Agilent Poroshell120 SB-Aq 色谱柱 ， 100×2.1 mm×2.7 pm， 部件号685775-914 ) ( Agilent Captiva RC 15 mm 针头过滤器 ， 部件号5190-5108 ) 安捷伦汉本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) 5991-9234ZHCN 利巴韦林和金刚烷胺属于抗病毒药物，在人类流感类疾病防治领域应用广泛。但有些违规养殖户会将其非法用于畜禽疫病防治，如此长期大量使用很容易诱导流感病毒变异，为动物疫病甚至人类流感类疫病的防治带来不确定性。此外，动物源食品中这些药物的残留不仅会造成食品风味和品质的下降，还会通过食物链进入人体，长期累积后会产生神经毒性，并直接诱导人类流感病毒产生变异及耐药性增强，从而威胁人类健康。因此，美国 FDA 和我国农业部都将这两个药物列入兽药禁止使用的范畴。这两个药物虽然已被禁用作兽药，但实际上还存在非法使用的现象，2012 年爆发的“速生鸡”事件，就是曝光了某些饲养企业在养鸡时使用了这两种抗病毒药物。本文建立了一种用于鸡肉、鸡蛋中利巴韦林和金刚烷胺同时分析的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法。