鸡肉中甲硝唑检测方案(液相色谱仪)

采用LC/QQQ 法测定肉肉中的甲硝唑 崔悦、曹冬北京市海淀区疾病预防控制中心 吴翠玲、薛彬 安捷伦科技(中国)有限公司 甲硝肖 (Metronidazole， MTZ) 是畜牧业生产中常用的一种硝基咪唑类药物，具有抗厌氧菌和抗原虫作用，主要用于治疗鸡、火鸡的组织滴虫病、牛毛滴虫病，还可与其它抗生素联合，用于治疗厌氧菌感染。但研究表明，该物质对人体具有神经毒性和潜在致癌性。鉴于此，欧盟和美国食品药品监督管理局禁止在动物源性食品中使用甲硝唑等硝基咪唑类药物。2002年12月，我国农业部修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，规定可使用甲硝唑治疗动物疾病，但禁止以抗应激、提高饲料报酬、促生长为目的将该药物用于所有食品动物，并规定所有食品动物可食性组织中甲硝唑的最高残留限量为零。为保障食品安全，建立动物性食品中甲硝唑残留的检测方法势在必行。 本研究利用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱净化鸡肉样品，并使用 Agilent 1290Infinity lI液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统分析样品中的甲硝唑残留。 对试料进行样品前处理。从所取全部样品中取出可食部分约500g，剔除筋膜，用组织匀浆机充分捣碎均匀，转入洁净容器中，密封并标记，于-18℃以下冷冻存放。称取均质样品4g(精确至0.01 g) 于50mL具塞聚丙烯塑料离心管中，加入40 pL 200 pg/L同位素内标工作液(将甲硝唑-13c-15N，标准品溶于甲醇从而完成制备)，加入4mL4%氯化钠水溶液(分析纯度)，涡旋混匀，超声处理 5 min，加入20mL乙酸乙酯(色谱纯度)提取，涡旋混匀，9000 r/min 4℃ 离心 5 min， 取 5mL上清液于 40℃氮气下吹干，用5 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液复溶待净化。 使用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱对所得样品提取液进行净化和富集，具体操作如下： Plexa PCX 固相萃取柱依次用5mL甲醇和5mL纯水活化。将5mL样品提取液分两次过柱，依次用0.1%甲酸(色谱纯度)水溶液和甲醇(色谱纯度)各5mL淋洗，抽干柱子，用滤纸将柱子擦干净，用5mL 5%氨化甲醇分两次洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹至近干，用1mL流动相重新溶解，过 0.2 pm Agilent Captiva RC 滤膜后，供仪器测定。 随后， 使用 Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统对其中的甲硝唑残留进行分析。液相色谱条件和梯度程序如表1所示，质谱分析条件和部分质谱仪参数分别如表2和表3所示。 表1.液相色谱条件 色谱柱 Agilent Zorbax Elipse Plus C18 柱， 2.1 mmx100 mm， 1.8 pm 流动相A 0.1%甲酸的水容液 流动相B 甲醇 梯度洗脱 时间(min) B(%) 0.0 10 0.5 10 2.0 90 3.0 90 3.5 10 5.0 10 流速 0.3mL/min 柱温 40°C 进样量 10 pL 表2.质谱分析条件 电离源 电喷雾正离子模式ESI (+) 毛细管电压 3.0kV 干燥气温度 350°C 干燥气流速 11L/h 雾化器压力 40 psi 质谱扫描方式 多反应监测离子(MRM) 表3.质谱部分仪器参数 化合物名称 母离子 (m/z) 锥孔电压 (V) 子离子(m/z) 碰撞能量(eV) 甲硝唑 172.1 90 128*82 33 甲硝唑-13C，-15N， 175.9 80 131.9 3 本文采用同位素标记内标法定量。用甲醇溶解甲硝唑标准品，制备得到100 pg/L 标准工作液，并逐级稀释、配制得到0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 pg/L系列标准溶液，并加入内标工作液(同位素标记内标为甲硝唑-13c，1N2)，使沐标浓度均为2.0 pg/L。以标准溶液浓度为横坐标，待测组分与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，按内标法计算样品中甲硝削的含量。通过绘制曲线得到，在 0.1-10 pg/L 线性范围内，甲硝唑的线性相关性良好，相关系数r>0.995。 样品中待测物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间一致，变化范围应在±2.5%之内。待则化合物定性离子的重构离子色谱峰的信噪比(S/N)≥3，定量离子重构离子色谱峰的信噪比 (S/N)≥10。同一检测批次，样品中的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，各离子对的相对丰度应与校准溶液的相对丰度一致，误差不超过表4中规定的范围。质谱分析所得的色谱质谱图如图1所示，样品及样品加标总离子流图如图2所示。 表4.定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度(%) ≤10 >10-20 >20-50 >50 允许相对偏差(%) ±50 ±30 ±25 ±20 图2.样品及样品加标总离子流图 在0.5、1、2 pg/kg的加标浓度下，每个加标浓度平行测定6次，进行方法回收率讨论。如表5所示，甲硝唑的回收率为78%-96%，RDS≤ 6.1%，表明该方法的回收率和精度完全满足甲硝唑的定量分析要求。 每10个样品测定1个加标回收率，样品数小于10个，至少测定1个加标回收率。回收率实验采用0.5、1、2 ug/kg三个加标浓度，每个加标浓度平行测定6次，回收率和精度见表5。通过对加标样品的总离子流图进一步分析得到，按3倍信噪比测得的检测限(LOD) 为 0.5 ug/kg， 以10倍信噪比测得的定量限 (LOQ)为1.5 pg/kg. 表5.甲硝唑加标回收率 物质名称 加标浓度(pg/kg) 回收率范围(%) 平均回收率(%) RSD (%) 甲硝唑 0.5 80.1-92.4 87.2 6.1 1 78.3-95.8 86.6 5.2 2 83.6-93.5 89.0 5.5 本文所述使用 Bond Elut PCX 固相萃取柱和1290 Infinity ⅡI液相色谱系统/6460三重四极杆液质联用系统分析鸡肉样品中甲硝唑的方法线性范围宽、样品回收率高、质谱信号良好，而且具有优异的检测限 (LOD)和定量限(LOQ)，在动物性食品兽药残留分析领域有很好的应用前景。 ( 1.2 2016年国家食品污染和有害因素风险监测工 作 手册[M]. 2016：342 — 349 ) ( 2. 农业部1025号公告-2-2008动物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代谢物残留检测液相色谱-串联质谱法 ) Agilent Bond Elut PCX 固相萃取柱，60 mg， 3mL， 部件号12108603 ( Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱 ， 100×2.1 m m， 1.8 um，部件号959764-902 ) ( Agilent Captiva RC 15 mm 针头过滤器，部件号5190-5108 ) 安捷伦汉本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) 甲硝唑 (Metronidazole, MTZ) 是畜牧业生产中常用的一种硝基咪唑类药物，具有抗厌氧菌和抗原虫作用，主要用于治疗鸡、火鸡的组织滴虫病、牛毛滴虫病，还可与其它抗生素联合，用于治疗厌氧菌感染。但研究表明，该物质对人体具有神经毒性和潜在致癌性。鉴于此，欧盟和美国食品药品监督管理局禁止在动物源性食品中使用甲硝唑等硝基咪唑类药物。2002 年 12 月，我国农业部修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，规定可使用甲硝唑治疗动物疾病，但禁止以抗应激、提高饲料报酬、促生长为目的将该药物用于所有食品动物，并规定所有食品动物可食性组织中甲硝唑的最高残留限量为零。为保障食品安全，建立动物性食品中甲硝唑残留的检测方法势在必行。本研究利用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 固相萃取柱净化鸡肉样品，并使用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统/ 6460 三重四极杆液质联用系统分析样品中的甲硝唑残留。