猪肉样品中大内环酯类物质检测方案(液相色谱仪)

( 作者 ) Rong-jie Fu 和 Chen-Hao (Andy) Zhai安捷伦科技(上海)有限公司 使用 Bond Elut QuEChERS dSPEEMR-Lipid 增强型脂质去除净化管和Poroshell 120 分析猪肉中的大环内酯类物质 应用简报 食品检测与农业 摘要 本应用简报描述了如何使用快速、简便、经济、高效、耐用和安全 (QuEChERS)的样品前处理方法来萃取和净化猪肉中的7种大环内酯类残留。我们分析了螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、红霉素、泰乐菌素、罗红霉素和交沙霉素残留。我们使用 Bond ElutQuEChERS dSPE EMR-Lipid增强型脂质去除净化管萃取分析物， 并在Agilent Poroshell120 EC-C18 HPLC 色谱柱上进行分离。通过液相色谱与阳离子多反应监模模式下运行的电喷雾离子化串联质谱联用完成定量分析。该方法对猪肉中的所有大环内酯类物质都具有较低检测限。这些化合物的动态校准范围在5-250 pg/kg 之间。总体回收率在63.9%-98.4%之间， 且 RSD值在3.8%-10.3%之间。 抗生素在食品动物产品中的使用为整个食品行业带来了诸多优势。然而，抗生素的使用引起了人们对于动物和人类健康安全的关注。大环内酯类是一组广泛用于治疗动物的多种呼吸系统和肠道细菌感染的抗生素。其中较为常用的大环内酯类物质包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、红霉素、泰乐菌素、罗红霉素和交沙霉素。 国家机构和国际组织针对动物源食品中的抗生素残留浓度设置了法规限度[1，2]。法规规定的残留限度在0-15 mg/kg 之间。此前开发了针对蜂蜜中痕量大环内酯类残留分析的应用[3]。该方法使用 Agilent Bond Elut Plexa 进行样品前处理，并使用 AgilentPoroshell 120 EC-C18 色谱柱进行分离。根据基质加标标准品得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合法规对蜂蜜中大环内酯类残留进行测定的要求。 表1.本研究中所用的大环内酯类化合物(接下页) 化合物 CAS号 结构 本研究的目的在于开发出简单、快速的多残留分析方法，用于猪肉中大环内酯类残留的常规法规分析。Agilent Bond Elut QuEChERSdSPE EMR-Lipid 增强型脂质去除净化管是一种新型吸附剂材料，能够选择性去除高脂肪含量基质(例如猪肉)中的主要脂质组分而不会造成分析物意外损失。去除复杂基质中的脂质干扰具有众多优势，包括降低基质效应以增强质谱响应，以及有助于延长液相色谱柱的使用寿命。Poroshell 120 HPLC 色谱柱采用表面多孔填料，分离速度快、效率高且背压较低。 表1显示了大环内酯类物质的详细信息。 表1.本研究中所用的大环内酯类化合物 化合物 CAS号 结构 竹桃霉素 3922-90-5 HO HO. 0 H H OW 、0H OH 0 CH. 0 泰乐菌素 1401-69-0 OH HO OH OH 罗红霉素 80214-83-1 CH. OH 材料与方法 6. 在 4000 rpm 下离心 5 min 7. 向15 mL EMR-Lipid 分散固相萃取管中加入5mL水 试剂与化学品 8. 移取 5mL 上清液至 EMR-Lipid 固散固相萃取管中 所有试剂均为质谱、HPLC或分析纯级。乙级和水购自 HoneywellInternational， Inc.。标准品购自 Dr. Ehrenstorfer (Augsburg，Germany)。猪肉购自当地超市。使用甲醇单独制备标准溶液(1.0 mg/mL)并在-20°℃下储存。混合工作溶液采用乙腈：水(10：80)制备，同样在-20℃下储存。然后在每日使用时用水对混合工作溶液进行适当稀释，制得加标溶液。 9. 立即涡旋混昆使样品分散，然后涡旋混合1 min 10. 在4000 rpm下离心3 min 11.移取5mL上清液至含有 2g盐 (1：4 NaCl：MgSO ) 的 15 mLEMR-Lipid Polish 反萃管中，并漩涡混合1 min ( 12.在4000 rpm 下离心 3 min ) ( 仪器与材料 ) ( Agilent 1290 Infinity LC ) 13.将200pL 上层 ACN 相与 800pL水合并到 2mL样品瓶中并涡旋混合 ( 配备电喷雾离子源的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统 ) 高效液相色谱条件 ( Agilent Bond Elut QuEChER S EN 萃取试剂盒(部件号 5982-5650) ) 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm， 2.7 pm(部件号695975-302) ( Agilent Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增强型脂质 去除净化管(部件号5982-1010) ) 流动相： A： 10mM 乙酸铵和0.1%甲酸水溶液 B：乙腈 进样量： 2pL Agilent Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid Polish 反萃管(部件牛5982-0101) Agilent Poroshell 120 EC-C18， 3.0×100 mm， 2.7 pm (部件号 695975-302) 流速： 0.5mL/min梯度： 时间 (min)065 6 65 ( Eppendorf 5810 离心机 (Brinkmann Instruments， Westbury， NY， USA) ) 8 20 柱温： 30°C 数字涡旋混合器 (VWR International， LLC， Radnor，Pennsylvania， USA) 质谱条件 在正离子模式下监测大环内酯类物质。表2列出了多反应监测的详细信息。 样品前处理 最终样品前处理流程按照以下步骤进行优化。 质谱离子源参数 气体温度： 300°C 1. 称取2.5g(±0.1 g)均质猪肉样品于 50mL离心管中 载气流速： 5 L/min 2. 加入 8 mL水， 涡旋振荡1 min 雾化器压力： 45 psi 鞘气温度： 400 °C 3. 加入10 mL 乙腈 鞘气流量： 11L/min 4. 将盐加入 QuEChERS EN 方法萃取试剂盒中 喷嘴电压： 正，0V 5. 振摇混合样品1 min 毛细管电压： 正， 4000 V 螺旋霉素 843.4 540.0 35 2.178 螺旋霉素 843.4 174.1 40 2.178 替米考星 869.5 696.4 320 44 2.749 替米考星 869.5 174.1 320 49 2.749 竹桃霉素 688.3 544.3 170 15 2.99 竹桃霉素 688.3 158.2 170 25 2.99 红霉素 734.4 576.3 180 14 3.204 红霉素 734.4 158.2 180 30 3.204 泰乐菌素 916.4 772.4 280 30 3.421 泰乐菌素 916.4 174.2 280 40 3.421 罗红霉素 837.4 679.3 200 16 4.087 罗红霉素 837.4 158.1 34 4.087 交沙霉素 828.4 174.1 35 4.461 交沙霉素 828.4 109.1 250 46 4.461 结果与讨论 线性与检测限 将混合工作溶液加标至空白基质中，制得用于创建外标校准曲线的溶液(5、10、20、50和250 ug/kg)。猪肉经过整个流程(包括预处理和QuEChERS步骤)处理，得到空白基质。通过进样浓度为 0.1 pg/kg 的后加标猪肉基质，根据信噪比 (S/N)3计算出检测限(LOD)数据。所有信噪比均大于3：1，因此所有这些化合物的 LOD均低于0.1 pg/kg，符合法规方法的要求。表3显示了校准曲线的结果。 95.2替米考星98.4表3.猪肉中大环内酯类物质的线性90.095.3化合物 回归方程 R2竹桃霉素92.4螺旋霉素Y=386.144x+19.317 96.4 0.999497.5替米考星 Y=133.272x+8.018 0.9999红霉素64.5竹桃霉素 Y=317.284x+43.963 0.999863.9红霉素 Y=848.506x+119.918 0.999668.7泰乐菌素泰 Y=274.158x+22.70乐菌素384.110.2 0.999793.3罗红霉素 Y=477.739x +53.019 0.999794.6交沙霉素 Y=625.922x+58.918 0.9998罗红霉素89.991.692.6交沙霉素87.992.493.2 回收率与重现性 在3个个肉样品加标加度(10、20和100 pg/kg) 下测定该方法的回收率与重现性，每个浓度的样品重复分析6次。表4列出了回收率和重现性数据。图1显示了20 pg/kg的加标猪肉提取物的色谱图。 表4.猪肉中大环内酯类物质的回收率和重现性(n=6) 化合物 加标浓度 (ug/kg) 回收率(%) RSD (%) 螺旋霉素 89.7 10.3 94.0 图 1. 20 pg/kg 加标猪肉样品萃取物的色谱图 结论 本应用简报介绍的方法能够可靠、快速且稳定地对猪肉中的大环内酯类残留进行同时定量分析与鉴定。EMR-Lipid 增强型脂质去除产品和 EMR-Lipid Polish 反萃管具有出色的基质净化效果，能够去除大部分基质(尤其是脂质)，且不会对分析物回收率造成显著影响。Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱能够快速分离多种大环内酯类物质，并可实现对称峰形和较高灵敏度。 ( 参考文献 ) ( 1. Anon. GB/T 2 3 408-2009. Determination of macrolides residues in honey-LC-MS/MS method.China Standard.General Administration of Quality S u pervision，Inspection and Q uarantine， Beijing， China ) ( 2. SN/T 1777.2-2007. Determination of macrolide antibiotic residues in animal-derived food - part 2：LC-MS/MS method. C hina Standard. General Administration of Quality Supervision， Inspection and Quarantine， Beijing， China ) ( 3. Chen-Hao Zhai， Rong-jie Fu. Macrolides in Honey Using Agilent Bond Elut Plexa S PE， Poroshell 120，a n d LC/MS/MS(使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE、P o roshell 120 和LC/MS/MS 分析蜂蜜中的大环内酯类物质)；安捷伦科技公司应用简报，出版号5991-3190EN， 2013 ) 更多信息 这些数据仅代表典型的结果。有关我们的产品与服务的详细信息，请访问我们的网站 www.agilent.com。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 c 安捷伦科技(中国)有限公司，2015 2015年11月12日，中国出版 5991-6442CHCN     摘要    本应用简报描述了如何使用快速、简便、经济、高效、耐用和安全(QuEChERS) 的样品前处理方法来萃取和净化猪肉中的7 种大环内酯类残留。我们分析了螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、红霉素、泰乐菌素、罗红霉素和交沙霉素残留。我们使用Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增强型脂质去除净化管萃取分析物，并在Agilent Poroshell 120 EC-C18 HPLC 色谱柱上进行分离。通过液相色谱与阳离子多反应监测模式下运行的电喷雾离子化串联质谱联用完成定量分析。该方法对猪肉中的所有大环内酯类物质都具有较低检测限。这些化合物的动态校准范围在5 - 250 μg/kg 之间。总体回收率在63.9% - 98.4% 之间，且RSD 值在3.8% - 10.3% 之间。    前言    抗生素在食品动物产品中的使用为整个食品行业带来了诸多优势。然而，抗生素的使用引起了人们对于动物和人类健康安全的关注。大环内酯类是一组广泛用于治疗动物的多种呼吸系统和肠道细菌感染的抗生素。其中较为常用的大环内酯类物质包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、红霉素、泰乐菌素、罗红霉素和交沙霉素。国家机构和国际组织针对动物源食品中的抗生素残留浓度设置了法规限度[1,2]。法规规定的残留限度在0 - 15 mg/kg 之间。此前开发了针对蜂蜜中痕量大环内酯类残留分析的应用[3]。该方法使用Agilent Bond Elut Plexa 进行样品前处理，并使用AgilentPoroshell 120 EC-C18 色谱柱进行分离。根据基质加标标准品得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合法规对蜂蜜中大环内酯类残留进行测定的要求。    结论    本应用简报介绍的方法能够可靠、快速且稳定地对猪肉中的大环内酯类残留进行同时定量分析与鉴定。EMR-Lipid 增强型脂质去除产品和EMR-Lipid Polish 反萃管具有出色的基质净化效果，能够去除大部分基质（尤其是脂质），且不会对分析物回收率造成显著影响。Agilent Poroshell 120 EC-C18 色谱柱能够快速分离多种大环内酯类物质，并可实现对称峰形和较高灵敏度。