动物源食品样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡等36 种兽药检测方案(液相色谱仪)

Jin-Lan Sun， Chang Liu， Yue Song 安捷伦科技(中国)有限公司，上海，200131，中国 Jian-Zhong Li 安捷伦科技(中国)有限公司，北京，100102，中国 采用LC/MS/MS结合改进的QuEChERS 方法对动物源食品中的36种兽药进行筛查 应用简报 食品检验和农业 本应用简报介绍了一种改进的 QuEChERS 方法， 可对食品中的四类兽药——磺胺类、大环内酒类、喹诺酮类和氯吡多进行筛查。改进的 QuEChERS 方法包括一个萃取盐包(4g Na，S0 +1 g NaCl) 和一个分散 SPE 试剂盒 (50 mg PSA、 150 mg C18EC 和900 mg Na，So)；萃取溶剂采用含1%乙酸的乙腈。采用该方法萃取这四类兽药均可获得满意的的收率。采用 LC/ESI/MS/MS， 在动态多反应监测(DMRM)模式下对这些兽药进行定量分析。方法得到的检出限符合这四类兽药的药 MRL要求， 并且平均回收率超过50%，因此满足常规分析的需要。 前言 QuEChERS方法最初用于水果和蔬菜中的农药萃取[1].QuEChERS 操作分为两个步骤，萃取/分配和分散 SPE (d-SPE)。在第一步中，乙腈作为萃取溶剂；使用硫酸镁和盐促进分配/萃取。在第二步中，采用 d-SPE去除萃取物中的基质干扰。d-SPE的材料一般包括N-丙基乙二胺(PSA)、封端C18 (C18EC) 和石墨化碳黑(GCB)。 通过验证， QuEChERS 方法已被用于多种样品基质的处理。相比于水果和蔬菜，本文涉及到的动物源食品样品需要在 d-SPE过程中采用 PSA 和 C18EC 去除这类样品中增加的蛋白质和脂类干扰。本文分析的兽药不需要使用 QuEChERS 缓冲盐， 即原 AOAC或 EN QuEChERS 方法系用于萃取 pH不稳定农药的盐。本方法由于其高选择性和高灵敏度，在分析复杂食品基质中痕量级的目标农药时非常耐用和快速。 与固相萃取(SPE) 相比， QuEChERS 方法会带来更多的基质干扰，因为它是一种“刚好够用”的样品制备技术。因此，需要高选择性的仪器，如使用带 DMRM 检测模式的 LC/MS/MS 对兽药进行简便准确的分析。 采用本文描述的 LC/MS/MS方法，动物源食品中的36种兽药可以在9 min 内实现有效的分离。本法联用快速 QuEChERS 萃取，减少了大量操作步骤和分析人员的时间，为常规工作中兽药的筛查提供了一个可靠的方法。 实验部分 试剂与标准品 所有试剂和溶剂均为 HPLC 级或者分析纯。甲醇(MeOH)和乙腈(ACN) 购自 Honeywell公司(马斯基根，密歇根州，美国)。甲酸(FA)和乙酸购自 Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。 溶液和标准溶液 将1 mL 甲酸加入100 mL ACN 中，混匀，制备1%甲酸 ACN溶液，每天新鲜配制。将1 mL乙酸加入100 mLACN中，混匀，制备1%乙酸 ACN 溶液，每天新鲜配制。 标准溶液制备的浓度为 10 pg/mL (磺胺类和大环内酯类)、5 pg/mL (氯吡多)和1pg/mL(喹诺酮类)。 仪器与材料 ( 配备二极管阵列检测器的 Agilent 1260 HPLC (安捷伦科技有限 公司，加利福尼亚州，美国)。 ) ( 带有 AJST 电喷雾离子源的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系 统(安捷伦科技有限公司，加利福尼亚州，美国)。 ) ( Agilent Bond Elut QuEChERS 硫酸镁(部件号5982-8082) ) ( Agilent Bond Elut 氯化钠(部件号5982-5750)Agilent Bond Elut PSA (部件号5982-8382或 5982-5753) ) ( Agilent Bond Elut C18EC(部件号5982-1382或 5982-5752) Agilent Bond Elut SAX (部件号 12213042) ) ( Agilent Bond Elut N H 2(部件号1 2 213021) 药物残留分析用 Agilent Bond Elut d-SPE (部件号5982-4956) ) ( Agilent Bond Elut QuEChERS 不带缓冲盐萃取试剂盒(部件牛 5982-5550) ) ( Agilent ZORBAX Solvent Saver HD E c lipse P lus C 18， 3 .0 X 100 mm，1.8 pm色谱柱( 部 件号959757-302) ) 仪器条件 HPLC条件 色谱柱： 柱温： 进样量： 流动相： 梯度程序： MS条件 干燥气温度： 干燥气流量： 雾化器压力： 毛细管电压： 鞘气温度： 鞘气流量： 扫描模式： 样品制备 样品浆 空白的猪肉、牛奶、蜂蜜和鸡蛋样品购自当地一家杂货店。样品洗净并剁碎(视需要)，然后于-20°℃保存。 萃取 取2克(±0.05g)各样品(视需要匀浆)，置于 50 mL 离心管中。向样品中加入 200 pL兽药标准溶液， 使浓度分别为 10 ng/g(磺胺类和大环内酯类)、5 ng/g(氯吡多)和1ng/g(喹诺酮类)。加入4mL 水，涡旋样品 1 min。每管中加入 10 mL 1%乙酸 ACN 溶液。盖上离心管并涡旋1 min。将萃取盐(4gNa，SO ， 1 g NaCl) 加入各管中。样品管加盖并且剧烈振摇1 min。 在4℃下以 5000 rpm 的速度离心5 min， 放置 30 min. 分散 SPE 取 6 mL 上层 ACN相， 转移至装有50 mg PSA、 150 mg C18EC和900mg无水Na，SO 的15mL试管中。将试管盖紧，涡旋1 min，然后以 5000 rpm 的速度离心5 min。将4 mL 上层 ACN 相转移至另一试管中，40℃ 下氮气吹干。用 1 mL ACN/H，0 溶液(2：8)复溶样品品渣，然后以10000 rpm 的速度离心10 min。将上层相溶液转移至自动进样瓶中。 结果与讨论 色谱条件优化 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统在 600 bar 的最高压力下可快速获得极高质量的数据结果。结合使用 Eclipse Plus C18亚 2 pm填料色谱柱，该分析系统可以改善分离度，缩短分析时间，提高检测灵敏度，这些改进对于兽药筛查都极为重要。 Agilent6460 MS/MS系统具有高检测灵敏度，先进的六极杆碰撞池可以消除背景噪音和交叉污染，并且创新的动态多反应监测 (DMRM)方法在 LC分离过程中即可根据每个分析物的保留时间窗建立离子对列表。 基质标准溶液中36种兽药(磺胺类和大环内酯类 10 ng/g、氯吡多5 ng/g和喹诺酮类1ng/g) 的 LC/MS/MS分离状况见图1。每种化合物的 MS 条件见表1。 18 19 23 24 22 58293313233343536373839 4414243444546474849551525354 图1.兽药的 MRM 提取离子流图 表 1. MRM transitions 和 MS操作参数 定量碰撞 定性碰撞 能量(V) 编号 保留时间 化合物名称 母离子 碎裂电压(V) 定量离子 能量(V) 定性离子 1.24 磺胺脒 215.0 80 108.0 20 156.0 9 2 2.75 林可霉素 407.2 150 126.0 30 359.0 15 3 2.68 氯吡多 192.1 110 101 25 87 30 4 2.78 磺胺醋酰 215.0 70 92.0 19 156.0 5 2.97 磺胺嘧啶 251.1 100 108.0 22 156.0 10 6 3.1 马波沙星 363.0 120 320.1 345.1 17 7 3.11 甲氧苄啶 291.2 150 123.0 22 230.1 22 8 3.15 磺胺噻唑 256.0 100 108.0 21 156.0 3.23 诺氟沙星 320.0 140 276.1 13 302.1 17 10 3.26 氧氟沙星 362.0 140 261.1 26 318.1 14 11 3.27 磺胺吡啶 250.1 100 156.0 10 184.0 14 12 3.36 环丙沙星 332.1 130 231.0 42 314.1 18 13 3.52 磺胺磺胺甲嘧啶 265.1 120 92.0 30 172.0 13 14 3.57 达氟沙星 358.2 140 255.0 46 340.1 22 15 3.76 恩氟沙星 360.0 130 316.2 18 342.1 18 16 4.05 磺胺二甲嘧啶 279.1 120 124.0 18 186.0 14 17 4.2 磺胺甲二唑 271.0 100 108.0 22 156.0 10 18 4.27 磺胺甲氧嗪 281.1 125 108.0 22 156.0 14 19 4.38 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 120 108.0 26 156.0 14 20 4.43 沙氟沙星 386.1 140 342.1 14 368.1 18 21 4.57 二氟沙星 400.0 140 356.1 18 382.1 18 22 4.91 螺旋霉素 843.5 200 101.0 46 174.0 42 23 5.07 磺胺间甲氧嘧啶 281.1 120 108.0 26 156.0 14 24 5.54 磺胺氯哒酮 285.0 100 108.0 22 156.0 10 25 磺胺多辛 311.1 120 92.0 30 156.0 14 26 6.21 磺胺甲唑 254.1 100 92.0 26 156.0 10 27 6.45 替米考星 869.6 250 174.0 50 696.4 45 28 6.65 磺胺异噁唑 268.1 100 113.0 10 156.0 10 29 萃取和分散 SPE 参数的改进 在初始评价阶段，我们使用安捷伦 Bond Elut 无缓冲盐和用于药物残留的 Bond Elut QuEChERS d-SPE 试剂盒。在方法开发期间， 我们发现有必要改进操作步骤。这些改进可以使回收率满足常规分析的要求，详情如下所述。这个方法已成功应用于如下样品基质的处理：肉类、蜂蜜、蛋类和奶类。 萃取步骤的优化 首先，药物残留的 d-SPE过程 (150 mg C18， 900 mg MgSO )在方法1、2、3和4(表2)中使用，以评价萃取步骤改进的效果。 萃取盐包 QuEChERS 方法使用 MgSO去除样品中的水分。实验表明，MgSO的使用对许多化合物的回收率有负面影响，尤其是磺胺类和大环内酯类药物。用 Na，SO 替代 MgSO，并且离心后将样品静置 30 min， 可以有效地吸收水分[2]。结果表明，用 Na，SO替代 MgSO， 可以提高磺胺类和大环内酯类药物的回收率(表2中的方法1和方法2)。 萃取溶剂 在萃取步骤中，还对水/乙腈的比例进行了评价。结果表明，萃取步骤中，采用比例为1：2的水/乙腈时，其回收率较比例为1：1时的好(表2中的方法2和方法3)。 肉类基质的许多样品制备技术中常用酸去切断化合物-蛋白质的结合，这会直接影响其回收率。通常用于这种目的的酸是甲酸和乙酸[3]。经比较表明，采用含1%乙酸的乙腈溶液处理样品的回收率大于采用含1%甲酸的乙腈溶液的处理效果。 (表2中的方法3和方法4)。 在四个方法的评价中，林可霉素的回收率都很低。推测是由于林可霉素具有强极性(log P=0.56)， 限制了乙腈对它的萃取。 表2.萃取步骤的不同方法优化结果 方法 2 3 萃取盐 MgSO+NaCl Na，SO +NaCl Na，SO+NaCl Na，SO +NaCl 分散 SPE 混合物 C18EC+MgSO C18EC+Na，SO， C18EC+Na，SO， C18EC+Na，SO. 萃取溶剂 1%甲酸乙腈溶液 1%甲酸乙腈溶液 1%甲酸乙腈溶液 1%乙酸乙腈溶液 水 8mL 8mL 4mL 4mL 大环内酯类药物的平均回收率 22.95% 43.66% 45.12% 70.46% 磺胺类药物的平均回收率 10.86% 25.96% 33.25% 54.35% 喹诺酮类药物的平均回收率 86.79% 47.69% 62.69% 64.44% 氯吡多的平均回收率 55.12% 38.02% 49.89% 65.37% d-SPE 的优化 当考察改进的 d-SPE 过程提高基质干扰去除的效果时，使用的盐包括了吸附基质中的蛋白质和脂类的C18EC 吸附剂[4]，和去除水分的无水 Na，SO。 改进参数包括 PSA (方法1和2)、SAX(方法3)和NH，(方法4) 。在 QuEChERS 方法中， PSA、NH， 和 SAX 因其阴离子交换特性已被用做 d-SPE材料。它们与基质中的极性有机酸、糖类和脂肪酸等酸性干扰有强烈的相互作用。 表 3.分散 SPE 参数优化结果 方法 1 2 3 4 5 萃取盐 Na，SO +NaCl NaSO +NaCl NazSO+NaCl Na，SO +NaCl Na，SO +NaCl 分散 SPE 混合物 50 mg PSA+ 100 mg PSA+ 50 mg SAX+ 100 mg NH，+ 300 mg C18EC+ 150 mg C18EC+ 150 mg C18EC+ 150 mg C18EC+ 150 mg C18EC+ 900 mg Na，SO 900 mg Na，S0 900 mg Na，SO 900 mg Na，SO 900 mg Na，SO 萃取溶剂 1%乙酸乙腈溶液 1%乙酸乙腈溶液 1%乙酸乙腈溶液 1%乙酸乙腈溶液 1%乙酸乙腈溶液 水 4mL 4mL 4mL 4mL 4mL 大环内酯类药物的平均回收率 54.57% 42.23% 59.87% 33.70% 66.10% 磺胺类药物的平均回收率 64.37% 63.27% 77.35% 51.71% 71.80% 喹诺酮类药物的平均回收率 73.88% 88.34% 76.82% 97.03% 84.66% 氯吡多的平均回收率 85.12% 100.11% 71.57% 70.27% 91.17% 表3的结果表明，方法1和5实现了最好的回收率，它们分别采用了添加或不添加 PSA 的 C18EC。我们的目的是可以找到一个适用于我们所有样品基质的 d-SPE 处理方法。因此，在d-SPE 过程中使用 PSA 非常重要，因为它可以去除蜂蜜基质中普遍存在的有机酸和糖。最终选择的 d-SPE 参数为 50 mg PSA、 150 mgC18EC 和900 mg Na，SO . 其他样品基质 除了肉类基质，本方法也成功用于蛋类、奶类和蜂蜜基质样品的处理。这些基质样品的回收率良好，满足常规兽药定量分析要求(附录)。 结论 采用改进的 QuEChERS方法，结合使用LC/MS/MS， 可以成功实现省时的动物源基质样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多兽药的筛查。本文优化的最佳QuEChERS组成为： 4gNa，SO、1g NaCl作为萃取盐，乙腈(1%乙酸)作为萃取溶剂，d-SPE过程中使用 50 mg PSA、 150 mg C18EC 和 900mg Na，SO。改进的QuEChERS 方法回收率满足常规兽药筛查的要求。 订购信息 种类 每包数量/规格 内容物 部件号 QuEChERS 萃取管 50包与试管 4 g NazS04， 1 g NaCl 5982-4950 分散SPE 50-15mL式管 50 mg PSA， 150 mg C18EC， 900 mg Na，SO4 5982-0032 ( 参考文献 ) 1. M. Anastassiades， S. J. Lehotay， "Fast and EasyMultiresidue Method Employment AcetonitrileExtraction/Partitioning and "Dispersive Solid-PhaseExtraction" for the Determination of Pesticide Residues inProduce"， J. A0AC Int.， 86，412-431 (2003). 2. George Stubbings & Timothy Bigwood，"The developmentand validation of a multiclass liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC/MS/MS) procedure forthe determination of veterinary drug residues in animaltissue using a QuEChERS (QUick， Easy， CHeap， Effective，Rugged and Safe) approach"，Analytica Chimica Acta，637，68-78(2009). 3. Jerry Zweigenbaum， et al，“使用三重串联四极杆液质联用仪和动态多反应监测功能 (DMRM) 进行复杂样品中农药多残留的快速定性定量分析，采用安捷伦分析方法包和农药化合物参数数据库进行快速而高效的方法开发”， 安捷伦科技有限公司，应用简报，出版号5990-4253CHCN 4. Angelika Wilkowska & Marek Biziuk “Determination ofpesticide residues in food matrices using the QuEChERSmethodology，" Food Chemistry， 125，803-812(2011). 更多信息 这些数据代表了典型的结果。如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 附录1.采用改进的 QuEChERS 方法处理四种基质中兽药的回收率和 LOQ 保留时间 肉类的回收率 肉类的 LOQ 蛋类的 蛋类的 奶类的 奶类的 蜂蜜的 蜂蜜的 化合物 (min) (猪肉)% (猪肉) (ng/g) 回收率(%) L0Q(ng/g) 回收率(%) LOQ (ng/g) 回收率(%) LOQ (ng/g) 林可霉素 2.7 12.61 0.012 10.77 0.013 12.74 0.018 7.18 0.025 螺旋霉素 4.9 75.31 0.813 45.57 0.293 74.46 0.476 54.72 0.431 替米考星 6.5 99.43 0.085 106.67 0.130 161.03 0.144 66.40 0.184 红霉素 7.1 26.10 0.027 39.76 0.017 36.67 0.013 25.60 0.030 泰洛星 7.4 68.29 0.083 47.08 0.126 69.18 0.524 63.89 0.145 罗红霉素 8.0 86.83 0.015 95.17 0.008 96.42 0.007 71.19 0.017 磺胺脒 2.7 23.96 0.678 43.95 0.719 42.16 0.339 46.59 0.127 磺胺醋酰 2.7 50.15 0.500 75.50 0.293 72.04 0.289 70.66 0.457 磺胺嘧啶 2.9 50.78 0.420 75.14 0.025 65.35 0.043 66.62 0.060 甲氧苄啶 3.0 83.71 0.026 83.22 0.009 83.53 0.013 82.72 0.014 磺胺噻唑 3.1 37.41 0.133 59.15 0.094 57.37 0.116 53.09 0.113 磺胺吡啶 3.2 46.22 0.037 70.50 0.029 63.07 0.035 64.50 0.024 磺胺磺胺甲嘧啶 3.4 54.98 0.373 68.24 0.106 63.83 0.052 66.89 0.060 磺胺二甲嘧啶 3.9 45.70 0.206 69.76 0.044 61.04 0.024 69.42 0.035 磺胺甲二唑 4.1 33.43 0.460 64.39 0.136 58.59 0.081 54.69 0.228 磺胺对甲氧嘧啶 4.1 41.96 0.025 71.82 0.010 59.34 0.022 60.48 0.022 磺胺甲氧嗪 4.2 40.36 0.039 75.35 0.066 70.40 0.123 68.04 0.097 磺胺间甲氧嘧啶 4.9 50.13 0.113 74.10 0.077 64.10 0.089 71.37 0.101 磺胺氯哒酮 5.3 48.26 0.124 71.89 0.107 63.97 0.108 66.32 0.042 磺胺地索辛 5.8 58.76 0.029 76.94 0.013 48.33 0.015 69.93 0.020 磺胺多辛 5.8 50.91 0.032 74.45 0.074 64.35 0.060 69.93 0.032 磺胺甲噁唑 45.82 0.135 76.80 0.072 69.80 0.050 71.15 0.077 磺胺异噁唑 51.23 0.154 72.43 0.056 66.84 0.051 68.77 0.160 磺胺苯酰 7.1 55.37 0.035 73.00 0.038 47.34 0.020 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误，或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明及指标如有变更，恕不另行通知。 C安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年5月4日，中国印刷 5991-0013CHCN Agilent Technologies     摘要    本应用简报介绍了一种改进的QuEChERS 方法，可对食品中的四类兽药——磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多进行筛查。改进的QuEChERS 方法包括一个萃取盐包（4 g Na2SO4 + 1 g NaCl）和一个分散SPE 试剂盒（50 mg PSA、150 mg C18EC 和900 mg Na2SO4）；萃取溶剂采用含1% 乙酸的乙腈。采用该方法萃取这四类兽药均可获得满意的回收率。采用LC/ESI/MS/MS，在动态多反应监测（DMRM）模式下对这些兽药进行定量分析。方法得到的检出限符合这四类兽药的各MRL 要求，并且平均回收率超过50%，因此满足常规分析的需要。    前言    QuEChERS 方法最初用于水果和蔬菜中的农药萃取[1]。QuEChERS 操作分为两个步骤，萃取/分配和分散SPE（d-SPE）。在第一步中，乙腈作为萃取溶剂；使用硫酸镁和盐促进分配/萃取。在第二步中，采用d-SPE 去除萃取物中的基质干扰。d-SPE 的材料一般包括N-丙基乙二胺（PSA）、封端C18（C18EC）和石墨化碳黑（GCB）。通过验证，QuEChERS 方法已被用于多种样品基质的处理。相比于水果和蔬菜，本文涉及到的动物源食品样品需要在d-SPE过程中采用PSA 和C18EC 去除这类样品中增加的蛋白质和脂类干扰。本文分析的兽药不需要使用QuEChERS 缓冲盐，即原AOAC或EN QuEChERS 方法系用于萃取pH 不稳定农药的盐。本方法由于其高选择性和高灵敏度，在分析复杂食品基质中痕量级的目标农药时非常耐用和快速。    与固相萃取（SPE）相比，QuEChERS 方法会带来更多的基质干扰，因为它是一种“刚好够用”的样品制备技术。因此，需要高选择性的仪器，如使用带DMRM 检测模式的LC/MS/MS 对兽药进行简便准确的分析。    采用本文描述的LC/MS/MS 方法，动物源食品中的36 种兽药可以在9 min 内实现有效的分离。本法联用快速QuEChERS 萃取，减少了大量操作步骤和分析人员的时间，为常规工作中兽药的筛查提供了一个可靠的方法。   结论    采用改进的QuEChERS 方法，结合使用LC/MS/MS，可以成功实现省时的动物源基质样品中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类和氯吡多兽药的筛查。本文优化的最佳QuEChERS 组成为：4 g Na2SO4、1 g NaCl 作为萃取盐，乙腈（1% 乙酸）作为萃取溶剂，d-SPE 过程中使用50 mg PSA、150 mg C18EC 和900 mg Na2SO4。改进的QuEChERS 方法回收率满足常规兽药筛查的要求。