高脂肪含量的牛油果样品中农药残留检测方案(液相色谱仪)

作者 Limian Zhao 和 Derick Lucas 使用 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品对牛油果中的农药多残留分析进行LC/MS/MS检测 应用简报 食品检测与农业 摘要 Agilent Bond Elut QuEChERS 增强型脂质去除产品 (Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid)为新一代样品前处理产品，可用于便捷的分散固相萃取 (dSPE)， 实现高度选择性的基质去除且不影响分析物回收率，尤其适用于高脂肪含量样品。本研究证明了此款全新产品在牛油果中44种农药残留的LC/MS/MS分析中的应用。流程依次为QuEChERS AOAC萃取以及 EMR-Lipid dSPE 和 EMR-Lipid盐析萃取，最终可实现快速和高效的样品净化。基质净化的评估方法为，在使用不同 dSPE 净化方法后测定牛油果萃取物中的非挥发性共萃取物含量，以及评估目标分析物的色谱基质效应。与其他基质净化产品相比，EMR-Lipid 分散固相萃取能实现更有效的基质净化且不会影响分析物回收率。优化方法在对牛油果中44种适用于 LC 分析农药的LC/MS/MS分析中获得了出色的精密度和准确度。EMR-Lipid dSPE 可轻松用于 QuEChERS 方法中，针对高脂肪含量牛油果样品中的农药残留实现快速、稳定、高效的样品前处理。 对于许多使用 QuEChERS 样品前处理方法(快速、简便、经济、高效、可靠和安全的样品前处理方法简称)的实验室来说，食品中农药残留的分析是他们的日常工作[1，2]。此方法通过一次萃取即可对数百种低浓度农药进行分析。尽管该方法对多种水果和蔬菜非常有效，但牛油果、坚果等高脂肪含量食品以及动物源食品却对该方法提出了新的挑战[3，4]。而对于希望满足政府机构为确保食品安全而制定的严格验证标准的实验室而言，克服这些挑战是他们的首要任务。 分析方法通过 LC 和 GC的结合来适应挥发性、半挥发性和不挥发性农药相关的多种类多残留方法需求[4]。虽然多数农药同时适用于 LC和GC，但也有相当一部分并非如此。从分析物定量和共萃取基质的负面影响来看，每种色谱技术均有其固有优势和劣势。去除这些共萃取物对于复杂食品基质中分析物的准确定量至关重要，因此需要使用 C18、PSA 和 GCB 等基质去除吸附剂对样品进行处理[5]。与典型基质去除吸附剂相比，市售含氧化锆的一些材料通常能够提升脂质去除能力。然而，这类材料无法适用于所有脂质类型，并且会保留目标分析物[6.7]。高脂肪含量样品还需要通过固相萃取小柱 (SPE) [7，8，9] 或凝胶渗透色谱 (GPC)[10]净化，因此在常规分析的基础上增加了时间和成本。 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除产品是一种新型吸 附材料，能够选择性去除样品基质中的主要脂类且不会造成分析 物意外损失。对于类似 QuEChERS 和蛋白质沉淀的技术来说，从 复杂基质中去除脂质干扰尤为重要，因为这些方法会随目标分析 物共萃取出大量基质。本研究的主要内容为依次采用 QuEChERS AOAC 萃取与 EMR-Lipid dSPE 净化，对牛油果中44种适用于 LC分析的代表性农药进行样品前处理。所选农药代表12种不同 类型的化学物质，用于为本应用简报中未涉及的分析物建立概念 验证。表1列出了适用于LC分析的农药及其类型。本应用简报 表明 EMR-Lipid可使牛油果等复杂脂肪样品获得极高的清洁度， 并使三种不同浓度下的44种农药残留具有高回收率和精密度。 表1.本研究中所采用的适用于 LC分析的农药及相应化学类别代表性农药 化学类别 农药分组 实验部分 所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯级。乙腈 (ACN) 和甲醇购自Honeywell (美国密歇根州马斯基根)。试剂级乙酸 (AA)购自西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。农药标准品和内标购自西格玛奥德里奇公司和AccuStandard (美国康涅狄格州纽黑文)。 溶液与标准品 向990 mL ACN 中加入 10 mL乙酸，制成含1% AA的乙腈。部分农药的标准品和内标(IS)储备液使用 ACN或甲醇配制，浓度为2.0 mg/mL。其余农药标准品均由市售混合标准品储备液制得，后者可直接用于制备标准工作溶液。混合工作溶液采用 ACN 制备，浓度为 25 pg/mL。实验中采用 ACN 制备 25 pg/mL TPP内标工作溶液。 实验采用 Agilent 1290 Infinity LC 进行分析， 其中包括： Agilent 1290 Infinity 四元泵 (G4204A) 配备 Agilent 1290 Infinity 自动进样器温控器 (G1330B)的Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器 (G4226A)，以及Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 该 UHPLC系统联用配备安捷伦喷射流电喷雾离子源并采用 iFunnel技术的 Agilent 6490三重四极杆液质联用系统。采用 AgilentMassHunter 工作站软件进行数据采集和分析。 仪器条件 高效液相色谱条件 色谱柱： Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18， 2.1×150 mm， 1.8 pm(部件号959759-902)； Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 UHPLC 保护柱，5×2.1mm， 1.8pm (部件号821725-902)设备流动相：A) 0.1% FA的水溶液样品前处理所使用的设备和材料包括：B) 0.1% FA的乙腈溶液流速：0.3mL/minGeno/Grinder (SPEX，美国新泽西州墨图根)柱温：35 °℃自动进样器温度：4°CCentra CL3R 离心机 (Thermo IEC， 美国马萨诸塞州)进样量：3pLEppendorf 微量离心管 (Brinkmann 仪器，美国纽约州韦斯注射针清洗：1：1：1：1ACN：MeOH：IPA：H，0， 含0.2% FA梯度：时间(min)%特伯里)0 们15 涡旋仪和多管涡旋仪(VWR， 美国宾夕法尼亚州拉德诺)15.01 100停止时间：16 min瓶口分液器(VWR， 美国新泽西州南普兰菲尔德)后运行时间：3 minEppendorf 移液器质谱条件正离子/负离子模式Agilent Bond Elut EMR-Lipid 增强型脂质去除净化管(部件载气温度：120°C号5982-1010) 和 Agilent Bond Elut EMR -Lipid polish 反气体流速：14 L/min萃管(部件号5982-0101)雾化器压力：40 psi鞘气温度：400°C鞘气流量：12 L/min毛细管柱：3000ViFunnel参数：正离子 负离子高压RF：100V 90V低压 RF：70V 60 V 分析物对应的 MS MRM 条件如表2所示，图1为典型色色图。 表2.本研究中所采用农药的三重四四杆 MRM 参数和保留时间 图1.加入50 ng/g 农药后依次经QuEChERS 萃取以及 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 净化得到的牛油果 样品的典型 LC/MS/MS 色谱图(MRM) 样品前处理 最终样品前处理流程采用 QuEChERS 工作流程通过以下步骤进行优化： 1.称尔15g(±0.1 g)均质牛油果样品于50mL 离心管中 2. 加入 15 mL乙腈(含1%AA)后涡旋混合10s 3. 加入一包 AOAC 萃取盐 4. 使用机械振荡器混合 2 min 5. 在5000rpm 下离心5 min 6. 向 15 mL EMR-Lipid dSPE 管中加入5 mL水 7. 移取 5mL上清液至 EMR-Lipid dSPE 管中 8. 立即涡旋混合使样品分散，然后在多管涡旋混合器中额外混合60s 9. 在 5000 rpm 下离心3 min 10.移取5mL上清液至 15 mL含有 2g 盐 (1：4 NaCl：MgSO )的 EMR-Lipid Polish 反萃管中，并漩涡混合1 min 11. 在 5000 rpm 下离心 3 min 12. 将 200pL 上层 ACN 相和 800pL水合并到2mL样品瓶中并漩涡混合 样品可直接进行 LC/MS/MS析析。完整的样品前处理流程如图2所示。 精确称取15g匀浆好的牛油果样品，置于50mL离心管中。 在 5000 rpm 下离心 5 min 向 QC样品中加入内标和标准品，并向除基质空白样品以外的所有样品中加入内标，然后漩涡振荡。 向 15 mL EMR-Lipid dSPE 管中加入 5 mL水和5mL上层乙腈萃取液。 加入15 mL 1%乙酸的乙腈溶液与 A0AC QuEChERS 萃取试剂盒。 涡旋混合并离心。 移取5 mL上清液至 EMR-Lipid Polish 反萃管中。 漩涡混合、离心，并根据需要将上层乙腈萃取液转移至另一样品瓶。 随后向基质空白中加入标准品和内标，制成基质匹配校准标样。 将200 pL ACN 萃取液与 800pL水混合、涡旋振荡，并根据需要进行离心。 图2.使用Agilent Bond Elut EMR-Lipid 进行牛油果中农药分析时的样品前处理流程 校准标样和质控样品 在步骤1之后将预加标 QC样品添加至相应混合标准工作溶液中以进行6次重复测定。QC样品的浓度对应于5、50和200 ng/g的牛油果样品。除空白基质外的所有样品中均加入内标溶液，浓度对应于 100 ng/g TPP 的牛油果样品。 基质匹配校准标样由标准品和内标工作溶液制得。步骤10之后，基质空白样品的浓度分别对应于1、5、10、50、100、150和200 ng/g 以及100 ng/g 内标 (TPP)。实验中采用水稀最最终样品萃取物，制成适用于LC/MS/MS梯度的样品，同时保持早期洗脱分析物的峰形完整性。利用上述最终稀释步骤， LC/MS/MS系统能够实现优异的灵敏度，同时能够满足检测限要求。如果仪器灵敏度无法满足样品稀释所能达到的检测需求，那么还应考虑样品浓缩(蒸发和复溶)这一非最佳方案。 共萃取物含量测定 通过失重测定法[2]测定采用 C18/PSA、氧化锆吸附剂和 EMR-Lipid 三种不同净化技术得到的萃萃取物含量。样品按以下步骤进行前处理，并采集数次重复测定的数据。 1. 110℃下加热玻璃管约1h 以除去水分 2. 将玻璃管冷却至室温 3. 预先对试管称重 4. 精确移取1mL原始空白基质萃取液(未净化)以及经各方法净化后的空白基质，各重复数次 5. 在CentriVap 中于50℃下将所有样品烘干1h或直至干燥 6. 110°℃下加热管约1h以除去水分 7. 将玻璃管冷却至室温 8. 再次对试管称重 步骤8和步骤3之后的重量差即为样品共萃取物的含量。净化前后基质共萃取物的平均重量差即为净化去除的共萃取物量。 基质效应评估 此外，实验还将后加标牛油果萃取物与等量纯溶液的分析物响应(峰面积)进行了对比。将农药标准溶液后加标至牛油果空白基质萃取液中，即制得了后加标牛油果萃取物。响应差异(峰面积)与基质效应直接相关。 方法对比与验证 目前， QuEChERS 法中首推除余 dSPE (成分为 PSA、EC-C18和MgSO) 用于净化牛油果等高脂肪含量样品。此外，据报道氧化锆吸附剂的除脂效率优于 C18/PSA dSPE。方法对比主要进行EMR-Lipid 净化与其他净化技术的对比。用于回收率数据对比的预加标和后加标样品对应浓度为 50 ng/g 的牛油果样品。实验中采用 A0AC QuEChERS 步骤进行萃取，随后各采用 EMR-Lipid、C18/PSA dSPE 和氧化剂吸附剂三种中的每种净化方案进行dSPE。 采用 EMR-Lipid 净化时，方案如图2所示。与传统 dSPE吸附剂不同， EMR-Lipid dSPE 需要额外加入水活活化材料，从而大大提升基质去除性能。将通过 EMR-Lipid 得到的上清液转移至EMR-Lipid 萃取盐中使 ACN/水发生相分离，并去除溶解态固体。采用通过 C18/PSA 和氧化锆净化的 QuEChERS时， 将1 mL ACN粗提液移取至2mL除 dSPE管(部件号5982-5122)中，或移取至含100mg 氧化吸吸附剂的2mL样品瓶中。随后将样品涡旋混合1分钟，并使用微量离心机以13000 rpm 的转速离心3分钟。将200pL上清液移取至盛有800uL水的样品瓶中。使用 C18/PSAdSPE 和氧化锆吸附剂净化时均会在这一步骤产生沉淀，因此LC/MS/MS分析前必须使用 0.45 um 再生纤维素滤瓶对样品进行过滤。目前认为沉淀由除脂 dSPE 和氧化锆净化中未除净的脂质造成。使用 EMR-Lipid 对粗提物进行净化时则不会发生这种情况，稀释后溶液澄清无沉淀，因此无需过滤。将后加标校准物加入对应的空白基质非常重要，这样才能制备出基质匹配的校准标样。将分析物峰面积预加标和后加标样品的峰面积相比即可计算出回收率。 EMR-Lipid 方法用证采用7点基质匹配校准曲线，在牛油果农残含量为5、50和200 ng/g 时通过6次重复测定进行。内标用于定量分析，同时数据以准确度和精密度形式列出。 基质效应评估 实验通过对比后加标空白基质与纯标准品的分析物响应来评估基质效应。由于绝大多数共萃取脂质在液相色谱梯度(反相，有机物比例由低到高)中较晚洗脱，因此疏水性分析物受样品基质的影响程度更大。这一效应通常被称为离子抑制，与较低的分析物响应有关。由于 C18/PSA 和氧化锆吸附剂的基质除脂效率较低，因此晚洗脱化合物的基质离子抑制效应更加明显。图3以三种化合物为例，表明 EMR-Lipid 净化对离子抑制的降低作用。这三种农药化合物的Log P值相对较高，其中氯苯胺灵为3.6，戊菌唑为3.7， EPN 为 4.5。LogP值越高，化合物的疏水性越强。这些农药表现出的高达80%的离子抑制由基质干扰所致，尤其是C18/PSA dSPE 和氧化锆吸附剂无法有效去除的脂质所产生的干扰。而对于这些化合物， EMR-Lipid 组未产生明显的干扰，如图3所示。 图3.疏水性分析物的基质效应对比。将含有农药标准品的基质样品以 50 ng/g的浓度后加标至空白基质中 针对分析物回收率的方法对比 研究中将采用 EMR-Lipid dSPE 的优化 QuEChERS 方法与采用C18/PSA 和氧化锆吸附剂 dSPE 净化的方法进行了对比。图4显示回收率的统计对比结果，图5则为特定棘手分析物的对比结果。 对多数农药而言，EMR-Lipid 方案总体可获得出色的回收率和精密度。仅有两种农药的回收率未达到70%-120%的范围，即嘧菌环胺(64%)和2，4-D酸(65%)， 且RSD小于10%。因此，根据SANCO 指南[11]得知，由于上述结果符合可接受的重现性标准，因而结果可以接受。除两种酸性化合物之外， C18/PSA dSPE 净 I回收率<70%或>120% 图4. Agilent Bond Elut EMR-Lipid、 C18/PSA dSPE 和氧化锆吸附剂的回收率统计对比结果 化均达到了良好的回收率。而PSA 使 2，4-D酸和滴丙酸表现出极低的回收率(<10%)。氧化锆吸附剂的回收率结果显示过多的分析物保留使吏种农药的回收率低于70%。 方法验证 实验通过运行完整的定量批处理实现 EMR-Lipid 方法的验证。方法在样品前处理章节中有详细描述。内标 (TPP) 用于进行定量分析，因此定量结果可定义为方法的准确度和精密度。而内标(TPP)的绝对回收率高于90%，因此准确度结果应与绝对回收率相对应。 详细的验证结果列于表4中，而根据三种浓度下共 18 次 QC 预加标样品重复测定计算得出的平均准确度和精密度生成的汇总图如图6所示。准确度结果表明44种农药中95%样品的准确度处于70%-120%的范围内， 2，4-D酸和嘧菌环胺除外，这两种农药的准确度稍低于70%， 但具有良好的 RSD。浓度为5、50和200 ng/g时分别有91%、100%和98%的农药具有 RSD 小于 10%(n=6)的优异方法重现性。使用 EMR-Lipid 法时，其他所有 RSD值均低于20%。对于 RSD 高于 10%的最低示标浓度化合物，仪器检测限可能是导致变异性较高的原因。无缓冲盐的EMR-Lipid盐析步骤(NaCl， MgSO ) 也是导致变异的潜在原因，因此以后的工作中将对缓冲盐析进行研究。 表4.牛油果中44种农药在5、50和200 ng/g 浓度下的 EMR-Lipid 方案验证结果(n=6) 校准曲线 方法准确度与精密度 计算范围 5 ng/g QC 50 ng/g QC 200 ng/g QC 分析物 回归拟合/权重 R2 (ng/g) 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 甲胺磷 二次拟合，1/x 0.9993 1-200 69.1 9.5 93.8 8.4 109.8 6.0 灭害威 线性拟合，1/x 0.9990 1-200 74.6 8.4 88.0 2.7 87.0 2.0 高灭磷 线性拟合， 1/x 0.9948 1-200 55.8 12.4 88.8 2.3 86.6 4.0 氧化乐果 线性拟合，1/x 0.9996 1-200 84.5 6.0 85.3 1.4 84.4 2.6 多菌灵 线性拟合，1/x 0.9995 1-200 87.1 6.3 86.2 2.2 85.4 1.2 噻菌灵 线性拟合， 1/x 0.9995 1-200 49.4 24.3 76.7 1.7 79.0 2.0 兹克威 线性拟合，1/x 0.9993 1-200 83.6 7.8 90.4 3.3 89.0 2.1 杀线威 线性拟合，1/x 0.9991 1-200 81.1 7.6 96.7 2.6 94.4 3.5 久效磷 线性拟合，1/x 0.9979 1-200 85.2 6.1 85.1 1.9 101.5 4.6 灭多威 线性拟合， 1/x 0.9993 1-200 77.8 8.2 88.6 3.3 92.8 4.5 非草隆 线性拟合， 1/x 0.9969 1-200 86.5 9.9 103.4 2.5 91.7 1.7 吡虫啉 线性拟合，1/x 0.9996 1-200 81.7 5.9 94.1 2.6 87.9 2.5 乐果 线性拟合，1/x 0.9993 1-200 83.3 8.0 99.2 3.1 94.8 2.5 TEPP-A 线性拟合， 1/x 0.9989 1-200 50.2 6.5 88.3 1.6 78.4 3.1 涕灭威 线性拟合， 1/x 0.9989 1-200 88.6 5.6 101.2 3.5 76.2 1.9 甲氧隆 线性拟合，1/x 0.9987 1-200 102.0 5.4 105.8 2.5 89.9 2.6 抑霉唑 线性拟合，1/x 0.9988 1-200 81.4 6.9 86.2 2.0 82.5 2.7 西玛津 线性拟合，1/x 0.9984 1-200 91.8 5.4 93.8 1.9 85.4 1.6 灭草隆 线性拟合，1/x 0.9990 1-200 82.5 9.9 96.0 3.7 88.4 1.8 甲基托布津 线性拟合， 1/x 0.9977 1-200 89.4 10.8 104.6 5.5 86.0 7.1 残杀威 线性拟合， 1/x 0.9993 1-200 84.7 8.1 97.6 1.4 94.5 2.2 克百威 线性拟合， 1/x 0.9993 1-200 88.3 8.5 98.9 5.1 97.2 2.4 绿麦隆 线性拟合，1/x 0.9990 1-200 96.3 5.0 97.9 3.1 89.9 2.0 敌草隆 线性拟合， 1/x 0.9995 1-200 86.6 6.7 98.7 2.8 97.5 3.5 甲萘威 线性拟合， 1/x 0.9991 1-200 图 6.使用 Agilent Bond Elut EMR-Lipid 工作流程获得的牛油果样品中44种代表性农药的定量分析结果。准确度和精确度数据根据三种不同浓度下共18次的重复测定计算得出 安捷伦开发出一种依次采用 QuEChERS AOAC 萃取和 Bond ElutEMR-Lipid dSPE 净化的快速、可靠与稳定的方法，经验证后该方法适用于牛油果样品中44种适用于 LC分析农药的分析。研究中对该方法的基质效应进行了详细评估，并与传统 C18/PSA dSPE和氧化锆吸附剂净化技术的基质效应进行了对比。结果表明，与C18/PSA dSPE 和氧化锆吸附剂相比，通过称重法和基质效应比较显示出 EMR具有出色的基质净化效果。研究中还对三种不同净化技术的分析物回收率和方法精密度进行了全面对比。EMR-Lipid净化的分析物回收率与 C18/PSA dSPE 相当，但共萃取物含量明显低得多。EMR-Lipid 和除脂 dSPE 净化的回收率都远优于氧化锆吸附剂，原因是氧化锆与分析物的相互作用没有选择性。数据表明 EMR-Lipid 能够去除多数基质，尤其是脂质，并且不会对分析物回收率造成显著影响。 本研究表明， 在QuEChERS工作流程中使用 EMR-Lipid 作为dSPE 吸附剂可获得优异的样品洁净度。而该吸附剂对共萃取脂质的高度选择性使其成为脂肪样品分析的最佳选择，且不受脂质含量和目标分析物类型的影响。EMR-Lipid 使牛油果样品中的农药定量分析实现了高回收率、高精密度、优异的基质去除效果以及简单易用性。将来的研究工作将继续着重于高脂肪含量复杂样品的多残留分析。 ( 参考文献 ) ( 1. . 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