牛骨骼肌中氨基糖苷类检测方案(液相色谱仪)

使用 Agilent Bond Elut Plexa SPE (即Agilent Poroshell 120色谱柱)和液相色谱/串联质谱系统分析牛骨骼肌中的氨基糖苷类 应用简报 食品检测和农业 作者 摘要 本文开发并验证了一种可同时测定牛骨骼肌中壮观霉素、潮霉素B、链霉素、双氢链霉素、阿米卡星、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素的氨基糖苷类残留物的方法。采用固相萃取来提取和净化分析物，使用液相色谱与电喷雾电离串联质谱在正离子多反应监测模式下对分析物进行定量。本方法对牛骨骼肌中的所有氨基糖苷类残留物都具有 ng/g 级检测限。这些化合物的动态校准范围在10ng/g 至500 ng/g 之间。总体回收率在71%到98%的范围内，相对标准偏差值在1.4%到11.2%之间。 引言 氨基糖苷类 (AG)是一类广谱抗生素，对一些好氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌活性。Ag 已广泛用于畜牧业治疗细菌感染或促进生长。由于它们具有毒性且可能造成抗生素抗性，因此这类抗生素对人类可能存在的潜在健康风险受到了极大关注。欧盟(EU)、中国、美国、日本和其他国家已经针对多种动物源食物中的 AG的最大残留水平颁布了严格的规定[1，2]. 本应用简报的目标在于开发一种多残留物的分析方法，用于动物组织中氨基糖苷类残留物简单、快速的常规监管分析。本方法依赖于使用了聚合吸附剂 (Agilent Bond Elut Plexa) 的简单固相萃取步骤。表1显示了β-拮抗剂的详细信息。 实验部分 试剂与化学品 所有试剂均为质谱、HPLC或分析纯级。乙级和水购自 Honeywell。标样购自 Dr. Ehrenstorfer(德国奥格斯堡)。牛骨骼肌购自当地超市。标样溶液(1.0mg/mL)分别在水中制备，储存在冷冻箱(4℃)内。混合工作溶液(10 pg/mL) 在乙腈：水 (10：90)中制备，也储存在4℃下。然后用水对混合工作溶液进行适当稀释，制得浓度较小的加标溶液。 样品前处理 使用厨用搅拌器将牛骨骼肌(500g)绞碎并储存于-20°℃下。称取5g等分碎肉放入50 mL 加盖聚丙烯管中，然后加入10mL5%的三氯乙酸 (TCA) 水溶液。所得混合物在 Ultra-Turrax T-18 搅拌器 (IKA-Labortechnik， Staufen，德国)中充分搅拌1 min， 然后在 4000 rpm 下离心5 min。将上层清液转移至另一个管内。使用 10 mL 5% TCA 水溶液重复进行相同的萃取步骤，将上层清液混入同一个管内。向萃取物中加入 5 mL 0.2 mol/L 的七氟丁酸(HFBA)水溶液。将上层清液涡旋混合1 min 并在4000 rpm下离心5min， 然后用5%氨水将其 pH 调为4.0。样品萃取溶液用水定容至30mL， 备好以进行后面的固相萃取。 固相萃取 图1显示了固了萃取步骤。使用3 mL乙腈(ACN) 对 Bond ElutPlexa 萃取柱进行预处理，然后用3mL 水和5 mL 20 mmol/L的HFBA水溶液进行平衡。然后将6mL样品溶液加载到萃取柱上，样品溶液在重力作用下穿过萃取柱(速度大约为1 mL/min)。萃取柱用 5 mL水进行淋洗。对萃取柱施加 5 min 全真空以使树脂完全干燥。用3mL ACN：0.2 mol/L HFBA 水溶液在1 mL/min 的流速下洗脱化合物。洗脱液在氮气环境中于40℃干燥。残留物重新溶解于1 mL 20 mmol/L 的 HFBA 水溶液中。然后对样品进行涡旋混合和超声以充分溶解残留物，并用0.22 pm膜对其进行过滤。然后将样品最终转移至2mL的色谱样品瓶中准备分析。 *洗脱液 ACN：0.2 mol/L HFBA 水溶液 (8：2)。 图1.牛骨骼肌净化和富集——固相萃取步骤 化合物 CAS 号 Log P 结构 化合物 CAS号 Log P 结构 59-01-8 -6.3 OH 壮观霉素 1695-77-8 -2.3 卡那霉素 NH OH HO，， HQ. HO- -OH H2N3 HO HO NH2 N` H2N- NH2 H H H OH 安普霉素 37321-09-8-6.5 OH 潮霉素B 31282-04-9 NA HN- CH HO- HN NH， HN HO -NH OH 妥布霉素 H2N OH 双氢链霉素 128-46-1 NA HO， 庆大霉素 1403-66-3 OH O HO OH 'HII H2N >=N OH H2N 新霉素 1404-04-22-7.8 HO OH N. NH2 NH2 NH2 阿米卡星 37517-28-5-7.4 HO ， ..0H H OH OH OH HN .OH H HN OH 表1.本研究中所用的氨基糖苷类化合物。 质谱条件 正离子模式下对 AG 进行监测。表2列出了多反应监测的详细 化合物 前体离子 产物离子 裂解电压(V) 碰撞能量 (V) 保留时间(min) 壮观霉素 351.2 333.2 170 15 4.64 207.1 170 18 潮霉素B 528.3 177.1 170 25 6.77 352 链霉素 582.4 263.2 6.98 245.8 35 双氢链霉素 584.4 263.3 30 7.06 246.2 40 阿米卡星 586.4 163.1 30 7.68 425.2 15 卡那霉素 485.3 163.1 20 7.8 324.2 10 安普霉素 540.3 217.1 25 8.32 378.2 12 妥布霉素 468.3 163.2 20 8.42 324.2 8 庆大霉素 478.3 322.3 8 8.64 157.2 15 新霉素 615.3 161.1 30 8.74 293.1 175 20 结果与讨论 回收率和重现性 线性和检测限 将混合工作溶液加标至空白基质中，制得用于创建外标校准曲线的溶液 (10 ng/g、20ng/g、50 ng/g、100 ng/g 和500 ng/g)。在整个步骤(包括预处理和固相萃取步骤)中去掉牛骨骼肌得到空白基质。将各种化合物高于 3：1信噪比 (S/N)时的浓度作为检测限(LOD)。校准曲线和 LOD的结果列在表3中。 在3个浓度下测定方法的回收率和重现性：牛肉加标浓度分别为20 ng/g、100 ng/g 和500 ng/g。 每个浓度下重复分析六次。表4列出了回收率和重现性数据。图2给出了加标牛骨骼肌萃取物(20 ng/g)的色谱图。 表4.牛骨骼肌中氨基糖苷类的回收率和重现性。 液相色谱-串联质谱是一种可靠而强大的技术，可同时定量和鉴定牛骨骼肌中的氨基糖苷类。此外，本研究结果显示， AgilentBond Elut Plexa 是一种适用于复杂基质(例如牛骨骼肌)中多种氨基糖苷类纯化和富集的有效方法。根据基质加标标样得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合国际法规测定牛骨骼肌中氨基糖苷类残留物要求。杂质和基质的影响甚微，并没有干扰任何目标标合物的定量。定量限显著低于 MRL [3]。 图 2.20 ng/g加标牛骨骼肌样品萃取物的色谱图 ( 参考文献 ) ( 1. W. Zhu， J. Yang， W. Wei， Y.L， S. Zhang. J. Chromatography A， 1207，29(2008). ) ( 2. A. Kaufmann， P . Butcher， K. Maden. Anal. Chim. Acta 711， 4 6 (2012). ) 3.Anon.GB/T 21323-2007 Determination of aminoglycosidesresidues in animal tissues-HPLC-MS/MS method. ChinaStandard. General Administration of Quality Supervision，Inspection and Quarantine， Beijing， China. 如需更多信息 这些数据仅代表典型结果。有关我们的产品和服务的详细信息，请访问我们的网站： www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 本资料中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2012中国印制2012年10月25日 5991-1321CHCN ) Agilent Technologies    摘要   本文开发并验证了一种可同时测定牛骨骼肌中壮观霉素、潮霉素B、链霉素、双氢链霉素、阿米卡星、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素的氨基糖苷类残留物的方法。采用固相萃取来提取和净化分析物，使用液相色谱与电喷雾电离串联质谱在正离子多反应监测模式下对分析物进行定量。本方法对牛骨骼肌中的所有氨基糖苷类残留物都具有ng/g 级检测限。这些化合物的动态校准范围在10 ng/g 至500 ng/g 之间。总体回收率在71% 到98% 的范围内，相对标准偏差值在1.4% 到11.2% 之间。    引言    氨基糖苷类(AG) 是一类广谱抗生素，对一些好氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抑菌活性。Ag 已广泛用于畜牧业治疗细菌感染或促进生长。由于它们具有毒性且可能造成抗生素抗性，因此这类抗生素对人类可能存在的潜在健康风险受到了极大关注。欧盟(EU)、中国、美国、日本和其他国家已经针对多种动物源食物中的AG 的最大残留水平颁布了严格的规定[1, 2]。    本应用简报的目标在于开发一种多残留物的分析方法，用于动物组织中氨基糖苷类残留物简单、快速的常规监管分析。本方法依赖于使用了聚合吸附剂(Agilent Bond Elut Plexa) 的简单固相萃取步骤。表1 显示了b-拮抗剂的详细信息。    结论    液相色谱-串联质谱是一种可靠而强大的技术，可同时定量和鉴定牛骨骼肌中的氨基糖苷类。此外，本研究结果显示，AgilentBond Elut Plexa 是一种适用于复杂基质（例如牛骨骼肌）中多种氨基糖苷类纯化和富集的有效方法。根据基质加标标样得到的回收率和重现性结果表明，本方法符合国际法规测定牛骨骼肌中氨基糖苷类残留物要求。杂质和基质的影响甚微，并没有干扰任何目标化合物的定量。定量限显著低于MRL [3]。