蛋白质中分子量确定检测方案

LC/MS 参数 作者 Ravindra Gudihal 与 Suresh Babu CV 安捷伦科技公司(印度) Bangalore India Ning Tang 安捷伦科技公司 Santa Clara， CA USA Madhavi H.N.和 Uma Maheswari GangaGen Biotechnologies Pvt. Ltd Bangalore， India 生物制药行业已将 LC/MS 广泛应用于治疗性蛋白质的分子量确定。这种方法快速、准确，可实现相对定量。准确的质量测量有助于确定预期的翻译后修饰(PTM)是否表达为正确的蛋白质序列，其还提供了同一样品中不同蛋白质或 PTM 的相对丰度。高分离度和高灵敏度质谱仪有利于这一分析的进行。本应用简报介绍了一种使用 Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪进行的完整蛋白质分析。 实验部分 样品 分别用0.1%甲酸 (FA) 的3%乙腈(ACN) 溶液和96.9%水溶液将单克隆抗体(mAb) 稀释到 100 pg/mL。进样量为1 pL (100 ng)。纯化蛋白质样品(P128) 购自 GangaGen BiotechnologiesPvt. Ltd， 溶于0.025%三氟乙酸 (TFA)的3%乙乙 (ACN) 溶液和96.9%水溶液中进行分析。 仪器 液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统质谱系统 配有安捷伦喷射流离子源的 Agilent6550 iFunnel Q-TOF 结果与讨论 蛋白质在电喷雾电离过程中会产生多电荷离子。单克隆抗体等大分子蛋白质具有如图1所示的电荷分布包迹。范围中心为电荷48。图中可以看到多个谱峰，它们表示 mAb上连接的不同糖型。使用 AgilentMassHunter BioConfirm 软件中的峰建模解卷积算法对质谱图进行解卷积。这种算法将多电荷质谱转换为零电荷质谱。图2显示了结果。 参数 Agilent 1290 液相色谱系统 色谱柱 Agilent Poroshell 300SB C8 1.0×75 mm， 5 pm 或 Agilent ZORBAX RRHD 300 Diphenyl， 2.1×100 mm，1.8 pm (部件号858750-944) 柱温 80°℃或 60℃ 样品恒温箱 5°C 流动相A 0.1%甲酸水溶液或 0.025% TFA 水溶液 流动相B 0.1%甲酸的90%乙腈水溶液 梯度 0-1 min 内B 为 3% 1-5 min 内B由3%升至90% 5-6 min 内 B 为 90% 6-7 min 内 B 为 3% 停止时间 7分钟 流速 0.4 mL/min 电离模式 正离子模式， ESI (Profile) 干燥气温度 290°C 干燥气流速 14 L/min 鞘气温度 400°C 鞘气流速 12 L/min 雾化器压力 20 psi 毛细管电压 5000V 喷嘴电压 2000 V 数据分析 LC/MS的数据采用 Agilent MassHunter 定性分析软件 B.06 及Agilent MassHunter BioConfirm 软件 B.06 进行分析 质荷比(m/z) 这种mAb 中观察到五种主要糖型。 图3和图4显示了治疗性蛋白质P128(分子量为26490 Da) 的另一个示例。 结论 研究证明，使用 Agilent 1290 Infinity液相色谱系统结合 Agilent 6550iFunnel Q-TOF 可对治疗性蛋白质进行分析 在完整蛋白质分析中， Agilent1290 Infinity 液相色谱系统表现出快速且卓越的分离能力，Agilent6550 iFunnel Q-TOF则具有极佳的分辨率和灵敏度 Agilent MassHunter BioConfirm 软件可实现自动化的数据提取、解卷积和蛋白质确认 图2.完整 mAb 的解卷积质谱图。主峰代表 mAb 上的主要糖型 图3.P128电荷分布包迹的 LC/MS原始数据，插图为 P128电荷状态的放大图 图4.P128的解卷积质谱图 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2013 2013年3月29日，中国出版5991-2116CHCN Agilent Technologies 前言生物制药行业已将 LC/MS 广泛应用于治疗性蛋白质的分子量确定。这种方法快速、准确，可实现相对定量。准确的质量测量有助于确定预期的翻译后修饰 (PTM) 是否表达为正确的蛋白质序列，其还提供了同一样品中不同蛋白质或 PTM 的相对丰度。高分离度和高灵敏度质谱仪有利于这一分析的进行。本应用简报介绍了一种使用 Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪进行的完整蛋白质分析。结论• 研究证明，使用 Agilent 1290 Infinity液相色谱系统结合 Agilent 6550iFunnel Q-TOF 可对治疗性蛋白质进行分析• 在完整蛋白质分析中，Agilent1290 Infinity 液相色谱系统表现出快速且卓越的分离能力，Agilent6550 iFunnel Q-TOF 则具有极佳的分辨率和灵敏度• Agilent MassHunter BioConfirm 软件可实现自动化的数据提取、解卷积和蛋白质确认