人血浆中克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-481Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-291 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测人血浆中克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉 滨 LCMSMS-291 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术测定人血浆中克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨的方法。人血浆样品经乙腈沉淀后，可在6 min内快速、准确地测定其中的克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨。本文考察了方法的线性、定量限、重复性、基质效应、质留；结果表明：克拉屈滨、克罗拉滨在 0.05~10 ng/mL 范围内线性良好，奈拉滨在 0.05~5 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.995；方法定量限为0.05 ng/mL；低、中、高浓度 QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在3.33~9.39%与87.69~108.00%之间；克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨低、中高浓度样品基质效应在 94.22~117.57%间，内标基质效应为94.87%。使用高灵敏度的 LCMS-8050系统，可以简化前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。 关键词：克罗拉滨克拉屈滨奈拉滨超高效液相色谱三重四极杆质谱 慢性淋巴细胞白血病 (CLL)是临床较常见的成人白血病，发病率约占所有白血病的5%；且CLL男性发病率高于女性，50岁后发病率呈显著增加趋势。核苷类似物在慢性淋巴细胞白血病 (CLL)中疗效确切，目前在临床治疗 CLL 使用较多的化疗药物为核苷类似物药物克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨等。核苷类似物能模拟天然核苷来干扰 DNA、RNA合成、DNA修复或者抑制有核苷(酸)参与的生物过程，从而阻碍癌细胞快速生长，继而达到抗癌效果。克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨进入 人体后，克拉屈滨和克罗拉滨通过脱氧胞苷激酶活化为单磷酸盐形式，而奈拉滨经鸟嘌呤核苷激酶活化；之后这3种药物转化为有活性的三磷酸盐而抑制DNA合成。 本文旨在建立一种人血浆中克罗拉滨、克拉屈滨、奈拉滨含量的检测方法，为研究人体内克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨代谢过程提供一种快速、灵敏、简便的检测方法，以契合合作机构*进一步同时分析人血浆中克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨及其活性代谢物含量的需求。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为LC-30ADx2输液泵， DGU-20A， 在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20A柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutionsLCMS Ver.5.85 版色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS Column(2.1 mm I.D . ×100 mm L.， 1.9 um，P/N 227-30048-02)流动相：A相-0.025%甲酸-2 mM 乙酸铵水溶液；B相-乙腈流速：0.45mL/min 进样体积：5uL 柱温：30℃ 样品温度：6℃ 洗针液： R0-50%甲醇水溶液；R1： 80%乙腈水溶液 ( 洗针模式：进样 前 后洗针， External&Internal(进样 针内外壁清洗) ) 内壁洗针程序：分析开始后4 min 进行清洗，内壁洗针体积 300pL； 平衡时间0.5 min。 外壁洗针体积：600 uL 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为2%时间程序见表1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 2 2.00 Pumps Pump B Conc. 90 2.00 Pumps Total Flow 0.45 2.01 Pumps Total Flow 0.6 4.30 Pumps Pump B Conc. 90 4.30 Pumps Total Flow 0.6 4.35 Pumps Pump B Conc. 2 4.35 Pumps Total Flow 0.45 6.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI，正离子模式分析 DL 温度：200℃ 离子源接口电压：4.5kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：干燥空气 10.0 L/min 驻留时间：30ms 干燥气：氮气10.0L/min 延迟时间：3ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2MRM参数 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre 碰撞能量 Q3 Pre [M+H (m/z) Bias (V) CE(V) Bias (V) 克拉屈滨 Cladribine 4291-63-8 286.05 170.05* -14.0 -15.0 -18.0 134.00 -14.0 -35.0 -23.0 克罗拉滨 Clofarabine 123318-82-1 304.00 170.05* -12.0 -27.0 -12.0 134.00 -11.0 -36.0 -27.0 奈拉滨 Nelarabine 121032-29-9 298.05 149.00* -14.0 -34.0 -26.0 166.10 -11.0 -18.0 -11.0 邻甲苯海拉明 Mephenamine 341-69-5 270.15 181.10 -15.0 -16.0 -15.0 *代表定量离子对 1.3标准品与试剂 克罗拉滨、克拉屈滨、奈拉滨标准品：含量99.7%，4℃保存。 邻甲苯海拉明(内标)：含量99.5%，4℃保存。 甲醇/乙腈： Merck公司，色谱级，室温保存。 实验用水：由Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：购自安谱公司，色谱级，纯度98%，室温保存。 乙酸铵：购自安谱公司，色谱级，纯度99%，室温保存。 1.4对照品溶液及内标溶液的配制 克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨标准储备液：取适量克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨标准储备液(50%甲醇水溶解，浓度均为100ug/mL)，用50%甲醇水稀释至1.0 ug/mL， 至适宜容器中于-20℃冰箱保存，备用。 克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨工作溶液：吸取适量克罗拉滨、克拉屈滨、奈拉滨储备液，用50%甲醇水溶液分别配制成浓度为2、5、10、20、40、80、160、300、400 ng/mL(克拉屈滨、克罗拉滨)、浓度为2、2.5、5、10、20、40、80、150、200 ng/mL(奈拉滨)工作液；临用时等体积混匀，得到克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨混合工作浓度分别为1/1/1、2.5/2.5/1.25、5/5/2.5、10/10/5、20/20/10、40/40/20、80/80/40、150/150/75、200/200/100 ng/mL； 至适宜容器中于4℃冰箱保存，备用。 邻甲苯海拉明(内标)标准储备液：精密精定1.02 mg 用甲醇溶解并定容至1mL混匀，至适宜容器中于-20℃冰箱保存备用。 邻甲苯海拉明(内标)标准工作溶液：用甲醇配制浓度为10 ng/mL标准工作液，临用前配制。 1.5样品制备 标准曲线样品：取人血浆95uL， 加入5 uL标准混合对照工作液、10 uL 内标工作液、涡旋混合30 s 后加入300uL乙腈涡旋混合1 min， 于14000 rpm 离心10 min； 取上层清液200 uL， 用200 pL纯水稀释， 以5uL 进样LC-MS/MS分析。 质控样品：取人血浆95 pL， 加入5 uL克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨的质控工作液、10 uL内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 基质样品：人血浆95 uL， 300 uL乙腈涡旋混合1 min， 加入5uL、克拉屈滨、克罗拉滨奈拉滨的标准工作液、10 uL 内标工作液，其余处理过程同标准曲线样品。 工作液样品：取纯水95 pL， 加入5uL克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉拉标准工作液、10 uL内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 结果讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 图1克拉屈滨一级质谱图 图2克拉屈滨产物离子质谱图 Inten. (x100，000) 图3克罗拉滨一级质谱图 图4克罗拉滨产物离子质谱图 图5：奈拉滨一级质谱图 图6奈拉滨产物离子质谱图 图7内标-邻甲苯海拉明一级质谱图 图8内标-邻甲苯海拉明产物离子质谱图 2.2标准曲线 取空白人血浆匀浆100pL， 按照样品处理方法制备，结果如图9~16所示。结果显示，人空白血浆中目标化合物克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨及内标的通道均不干扰定量限样品的检测。 图9空白血浆MRM谱图-克拉屈滨 图10血浆样品MRM谱图-克拉屈滨(0.05 ng/mL) 图11l 3空白血浆MRM谱图-克罗拉滨 图121血浆样品MRM谱图-克罗拉滨(0.05 ng/mL) (x1，000) 2：KLLB 304.00>134.00(+) CE：-36.0 图13空白血浆MRM谱图-奈拉滨 图144血浆样品MRM谱图-奈拉滨(0.05 ng/mL) 图15空白血浆MRM谱图-邻甲苯海拉明 图16.血浆样品MRM谱图-邻甲苯海拉明 2.3线性范围 图17克拉屈滨血浆校准曲线 图18克罗拉滨血浆校准曲线 图19奈拉滨血浆校准曲线 人血浆配制校准曲线样品浓度分别为 0.05 ng/mL、0.125 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、7.5 ng/mL、10 ng/mL(克拉屈滨、克罗拉滨)；0.05 ng/mL、0.0625 ng/mL、0.125 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、3.75 ng/mL、5 ng/mL(奈拉滨)。标准曲线如图17、18、19所示，线性方程及相关系数见表3，其中y值代表待测物质与内标物质峰面积的比值，x值代表血浆中待测物质浓度比。 表3克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨校准曲线参数(线性回归，权重为1/C) 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 克拉屈滨 Y=2.35695X-0.0102252 0.05~10 92.8~108.5% 0.9979 克罗拉滨 Y=3.01208X-0.025333 0.05~10 91.3~110.8% 0.9987 奈拉滨 Y=6.09818X-0.160856 0.05~5 88.1~108.7 0.9987 2.4基质效立 基质效应考察结果如表4所示。 表4基质效应(n=6) 浓度 基质效应 理论浓度 理论浓度 理论浓度 水平 克拉屈滨 克罗拉滨 奈拉滨 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) LQC 0.0625 117.57 0.0625 101.27 0.0625 100.02 MLQC 0.4 96.14 0.4 102.62 0.25 109.29 MQC 5.0 94.22 5.0 100.53 2.5 107.68 HQC 7.5 103.49 7.5 101.27 3.75 100.35 内标 94.87 结果表明，克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨低、中、高浓度样品及内标的基质效应在94.22~117.57%之间。2.5精密度与准确度 考察四个浓度水平质控样品的日内精密度，结果如表5所示。 表5方法精密度与准确度(n=6) 待测物质 精密度 准确度 待测物质 精密度 准确度 待测物质 精密度 准确度 样品浓度 RSD% Accuracy% 样品浓度 RSD% Accuracy% 样品浓度 RSD% Accuracy% (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) 克 0.0625 6.66 91.00 克 0.0625 9.39 101.92 奈 0.0625 4.70 87.69 拉 0.4 8.51 108.00 罗 0.4 3.33 97.70 0.25 5.35 97.21 拉 屈 5.0 4.64 89.87 拉 5.0 4.68 89.00 滨 2.5 7.70 106.79 滨 7.5 4.34 99.14 滨 7.5 6.66 87.96 3.75 4.76 102.99 结果表明，克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨低、中、高浓度样品日内精密度在 3.33~9.39%之间；准确度在87.69~108.00%之间。 2.6残留 在高浓度样品(STD9)后进样分析空白样品，结果克罗拉滨、克拉屈滨、奈拉滨及内标物质检测通道均无目标化合物干扰。 (x1，000) (x1，000) -286.05>170.05(+) 3.0-304.00>170.05(+) 2.5 图22奈拉滨残留考察图谱 图23邻甲苯海拉明残留考察图谱 结论 克拉立滨、克罗拉滨在0.05~10 ng/mL 范围内线性良好，奈拉滨在0.05~5 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.995；方法定量限为 0.05 ng/mL；低、中、高浓度QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在 3.33~9.39%与 87.69~108.00%之间；克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨低、中高浓度样品基质效应在 94.22~117.57%间，内标基质效应为 94.87%。使用高灵敏度的 LCMS-8050系统，可以简化前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本；从而契合合作机构进一步同时分析人血浆中克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨及其活性代谢物含量的需求。 岛津全球应用技术开发支持中心 本文考察了方法的线性、定量限、重复性、基质效应、残留；结果表明：克拉屈滨、克罗拉滨在0.05~10 ng/mL范围内线性良好，奈拉滨在0.05~5 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.995；方法定量限为0.05 ng/mL；低、中、高浓度QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在3.33~9.39%与87.69~108.00%之间；克拉屈滨、克罗拉滨、奈拉滨低、中高浓度样品基质效应在94.22~117.57 %间，内标基质效应为94.87 %。