人血浆中依折麦布及其代谢物检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-480Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-290 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用检测人血浆中依折麦布及其代谢物 LCMSMS-290 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱和三重四极杆质谱联用技术测定人血浆中依折麦布及其代谢物-依折麦布葡萄糖酸苷的方法。人血浆样品经乙乙沉淀后，可在7min内快速、准确地测定其中的依折麦布及其代谢物-依折麦布葡萄糖酸苷的含量。本文考察了方法的线性、定量限、重复性、基质效应、残留；结果表明：依折麦布在0.03~4ng/mL范围内线性良好，依折麦布葡萄糖酸苷在0.3~40 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.995；依折麦布与依折麦布葡萄糖酸苷方法定量限分别为 0.03 ng/mL和 0.3 ng/mL ；LLOQ、低、中、高浓度QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在 0.73~2.87%与 87.68~108.03%之间；依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷低、中高浓度样品基质效应在 98.76~110.02%之间，内标基质效应为98.76%。使用高灵敏度的LCMS-8050 系统，可以简化前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。 关键词：依折麦布 依折麦布葡萄糖酸苷超高效液相色谱三重四极杆质谱 高胆固醇血症是动脉粥样硬化和冠心病的主要危险因素。临床试验证明降低血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平能够显著降低冠心病的发生率和病死率。有研究表明，位于小肠粘膜刷状缘的一种特殊转运蛋白尼曼-匹克C1型类似蛋白1 (Niemann-Pick C1 Like 1，NPC1L1)对胆固醇的吸收起至关重要的作用。依折麦布是唯――个选择性抑制NPC1L1蛋白活性的药物，“能够使小肠吸收胆固醇量降低50%以上。依折麦布口服进入机体后，在小肠中被迅速代谢成活性的葡萄糖醛酸结合形式，之后在肝脏中进一步葡萄糖醛酸化，随后分泌入胆汁，通过肝肠循环持续作用于小肠上皮的NPC1L1靶点。由于依折麦布及其活性代谢产物极性差异较大，同时检测对血浆样品前处理方式及色谱条件有较高的要求。 本文旨在建立一种快速、灵敏、简便的同时检测人血浆中依折麦布及其活性代谢物依折麦布葡萄糖酸苷含量的方法，以契合合作单位*临床样品分析高效、低成本的需求。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质杆仪 LCMS-8050联用系统。具体配置为LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20A 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions LCMS Ver.5.85 版色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS Column (2.1 mm I.D.×100 mm L.， 1.9 um， P/N 227-30048-02) 流动相：A相-0.025%甲酸-水溶液；B相-乙腈 流速：0.45 mL/min 进样体积： 10 uL 柱温：30℃ 洗针液：R0-50%甲醇水溶液；R1：80%乙腈水溶液 样品温度：6℃ 洗针模式：进样前后洗针， External & Internal (进样针内外壁清洗) 内壁洗针程序：分析开始后5.5 min 进行清洗，清洗液体积800 uL；平衡时间 0.8 min。 外壁洗针体积：1000 uL 洗脱方式：采用梯度洗脱，B相初始浓度为20% 时间程序见表1 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 20 4.00 Pumps Pump B Conc. 80 4.00 Pumps Total Flow 0.45 4.01 Pumps Total Flow 0.65 4.50 Pumps Pump B Conc. 80 5.00 Pumps Pump B Conc. 98 6.00 Pumps Pump B Conc. 98 6.00 Pumps Total Flow 0.65 6.01 Pumps Pump B Conc. 20 6.01 Pumps Total Flow 0.45 7.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式：ESI，负离子模式分析 DL 温度：250℃ 离子源接口电压：-3.5kV雾化气：氮气3.0 L/min加热气：干燥空气10.0 L/min干燥气：氮气10.0L/min 加热模块温度：300℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 驻留时间： 30ms 延迟时间： 3ms 碰撞气：氩气 MRM 参数：见表2 表2 MRM参数 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre 碰撞能量 Q3 Pre M-H (m/z) Bias (V) CE(V) Bias (V) 依折麦布 Ezetimibe 163222-33-1 408.15 271.15* 28.0 20.0 29.0 175.05 28.0 32.0 26.0 依折麦布葡萄糖酸苷 190448-57-8 64-77-7 584.20 269.10 271.15* 30.0 30.0 11.0 {Ezetimibe B-D-Glucuronide 175.05 30.0 22.0 13.0 甲苯磺丁脲 Tolbutamide 170.10 13.0 17.0 27.0 *代表定量离子对 1.3标准品与试剂 依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷标准品：含量99.7%，4℃保存。 甲苯磺丁脲(内标)：含量99.6%，44℃保存。 甲醇/乙腈： Merck公司，色谱级，室温保存。 实验用水：由Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得。 甲酸：购自 Sigma 公司，色谱级，纯度>99%，室温保存。 乙酸铵：购自安谱公司，色谱级，纯度>99%，室室温保存。 1.4对照品溶液及内标溶液的配制 依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷标准储备液：取适量依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷标准储备液(乙腈溶解，浓度均为1000 u/mL)， 用乙腈稀释至 1.0 ug/mL 和10.0 ug/mL，至适宜容器中于-20℃冰箱保存，备用。 依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷工作溶液：吸取适量依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷储备液，用乙腈分别配制成浓度为1.2、2、4、8、16、40、80、120、160 ng/m (依折麦布)、浓度为12、20、40、80、160、400、800、1200、1600 ng/mL (依折麦布葡萄糖酸苷))工作液；临用时等体积混匀，得到依折麦布及其代谢物混合工作浓度分别为0.6/6、1/10、2/20、4/40、8/80、20/200、40/400、60/600、80/800 ng/mL；至适宜容器中于4℃冰箱保存，，备用。 甲苯磺丁脲(内标)标准储备液：精密称定1.01 mg用乙腈溶解并定容至1mL混匀，至适宜容器中于-20℃冰箱保存备用。 甲苯磺丁脲(内标)标准工作溶液：用甲醇配制醇度为 20 ng/mL 标准工作液，临用前配制。 1.5样品制备 标准曲线样品：取人血浆95uL， 加入5 uL标准混合对照工作液、10 uL内标工作液、 Excellence in Science 涡旋混合30s后加入350 uL 乙腈涡旋混合1 min， 于14000 rpm 离心10 min ；取上层清液200pL，用200 uL纯水稀释，，以 10 uL 进样LC-MS/MS分析。 质控样品：取人血浆95uL， 加入5 uL依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷的质控工作液、10 pL内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 基质样品：人血浆95 pL， 300 pL 乙腈涡旋混合1min， 加入5 pL依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷标准工作液，10uL 内标工作液，其余处理过程同标准曲线样品。 工作液样品：取纯水95 uL， 加入5 uL依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷标准工作液、10 pL内标工作液、其余处理过程同标准曲线样品。 结果讨论 2.1标准样品一级质谱图与产物离子扫描质谱图 Inten. (x1，000，000) 图1依折麦布一级质谱图 图2依折麦布产物离子质谱图 图3依折麦布葡萄糖酸苷一级质谱图 图4依折麦布葡萄糖酸苷产物离子质谱图 图5内标-甲苯磺丁脲一级质谱图 图6 内标-甲苯磺丁脲产物离子质谱 2.2选择性 取空白人血浆匀浆100 uL， 按照样品处理方法制备，结果如图7~12所示。结果显示，人空白血浆中目标化合物依折麦布及其代谢物及内标的通道均不干扰定量限样品的检测。 图7空白血浆 MRM 图-依折麦布 图8血浆样品 MRM 图-依折麦布(0.03ng/mL) 图9空白血浆 MRM 谱图-依折麦布葡萄糖酸苷图10血浆样品MRM 图-依折麦布葡萄糖酸苷(0.3ng/mL) 图11空白血浆 MRM 图-甲苯磺丁脲 图12血浆样品 MRM 冬-甲苯磺丁脲 2.3线性范围 图13依折麦布血浆校准曲线 图14依折麦布葡萄糖酸苷血浆校准曲线 人血浆配制校准曲线样品浓度分别为 0.03 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.4 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、4 ng/mL(依折麦布)； 0.3 ng/mL、0.5 ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40 ng/mL (依折麦布葡萄糖酸苷)。标准曲线如图13、14所示，线性方程及相关系数见表3，其中y值代表待测物质与内标物质峰面积的比值，x值代表血浆中待测物质浓度比。 表3依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷校准曲线参数(线性回归，权重为1/C) 名称 校准曲线 线性范围(ng/mL) 准确度(%) 相关系数r 依折麦布 Y=21.55852X+0.000286787 0.03~4.0 89.6~103.8% 0.9999 依折麦布葡萄糖酸苷 Y=6.09818X-0.160856 0.3~40 96.9~104.7 0.9999 2.4基质效应 基质效应考察结果如表4所示。 表4基质效应(n=6) 浓度 基质效应 理论浓度 理论浓度 依折麦布 水平 依折麦布 (ng/mL) (ng/mL) 葡萄糖酸苷 LQC 0.08 101.15 0.8 110.02 MQC 0.35 99.47 3.5 101.11 HQC 3.2 101.92 32 100.90 内标 98.76% 结果表明，依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷低、中、高浓度样品及内标的基质效应在98.76~110.02%之间。 2.5精密度与准确度 考察四个浓度水平质控样品的日内精密度，结果如表5所示。 表5方法精密度与准确度(n=6) 待测物质/ 精密度 准确度 待测物质/ 精密度 准确度 样品浓度 RSD% Accuracy% 样品浓度 (ng/mL) RSD% Accuracy% (ng/mL) 0.03 2.60 108.03 0.3 0.65 102.23 依折 0.08 2.87 106.63 依折麦布 0.8 2.53 90.59 麦布 0.35 1.77 98.93 葡萄糖酸苷 3.5 2.81 87.68 3.2 0.73 103.45 32 0.81 92.60 结果表明，依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷低、中、高浓度样品日内精密度在0.73~2.87%之间；准确度在87.68~108.03%之间。 2.6残留 在高浓度样品 (STD9) 后进样分析空白样品，结果依折麦布、依折麦布葡萄糖酸苷及内标物质检测通道均无目标化合物干扰。 图20依折麦布残留考察图谱图21依折麦布葡萄糖酸苷残留考察图谱 图22甲苯磺丁脲残留考察图谱 结论 依折麦布在0.03~4 ng/mL 范围内线性良好，依折麦布葡萄糖酸苷在 0.3~40 ng/mL 范围内线性良好，相关系数均大于0.99；依折麦布与依折麦布葡萄糖酸苷方法定量限分别为0.03 ng/mL 和0.3 ng/mL ；LLOQ、低、中、高浓度QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在0.73~2.87%与 87.68~108.03%之间；依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷低、中高浓度样品基质效应在98.76~110.02%之间，内标基质效应为 98.76%。使用高灵敏度的LCMS-8050 系统，可以简化前处理过程，在提高分析效率的同时，显著降低成本。 田岛津全球应用技术开发支持中心 人血浆样品经乙腈沉淀后，可在7 min内快速、准确地测定其中的依折麦布及其代谢物-依折麦布葡萄糖酸苷的含量。方法线性、定量限、重复性、基质效应、残留分别为：依折麦布在0.03~4 ng/mL范围内线性良好，依折麦布葡萄糖酸苷在0.3~40 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.995；依折麦布与依折麦布葡萄糖酸苷方法定量限分别为0.03 ng/mL和0.3 ng/mL；LLOQ、低、中、高浓度QC样品连续进样6次，其精密度与准确度分别在0.73~2.87%与87.68~108.03%之间；依折麦布及依折麦布及依折麦布葡萄糖酸苷低、中高浓度样品基质效应在98.76~110.02 %之间，内标基质效应为98.76 %。