细胞培养用培养基中糖、氨基酸、维生素、核苷类化合物等检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-454Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-278 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 利用LC-MS/MS分析三种用于抗体药物生产的培养基组分差异 LCMSMS-278 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用同时测定3种用 于抗体药物生产的培养基中95种化合物的方法。该方法在 17 min 内完成95种化合物的分析，速度快、重复性好、灵敏度高，适合用于抗体药物生产的培养基中氨基酸类、维生素类和其他类影响因子的高灵敏度快速检测。利用该方法可快速对比不同类别和不同批次培养基之间的组分差异，从而根据抗体生产的要求选择合适的培养基，提高抗体生产效率。 关键词：超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪抗体药物生产培养基 动物细胞大规模培养和抗体质量分析已然成为抗体药物产业化的主要限制因素。培养基优化作为动物细胞大规模培养的关键环节，对抗体质量的影响显得尤为重要。众所周知，培养基开发工作与生产用细胞株特征关系密切，因此，在培养基开发过程中需要围绕生产用细胞株的特点进行“个性化培养基”的设计与优化，了解每种细胞在培养过程中对各种营养成分的消耗，以及自身分泌物对细胞生产繁殖的影响。 为满足快速全面分析细胞培养基组分，将基础碳源、氮源、核苷酸、维生素和其他主要代谢物一起检测分析， 得到更多有关生物过程中的详细信息，我们开发出“细胞培养上清液方法包”。该技术平台采用超高效液相色谱三重四极杆液质联用仪，仅需17分钟，即可同时监测分析95种细胞培养上清液营养成份和代谢物的相对丰度变化。 本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱 LCMS-8045联用，利用“细胞培养上清液方法包”建立了用于抗体药物生产的培养基中营养物质和细胞代谢物的液相色谱-串联质谱的同时分析方法，供相关人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用系统。具体配置为： LC-30ADx2输液泵， DGU-20A，在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器，LCMS-8045 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.86 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 分析仪器： LC-30A系统干燥气：氮气15 L/min色谱柱：见“细胞培养上清液方法包”加热气：空气10 L/min流动相：见“细胞培养上清液方法包”碰撞气：氩气流速：0.35mL/min脱溶剂管温度：250℃进样体积：1pL加热模块温度：400℃柱温：40℃接口温度：300℃洗脱方式：梯度洗脱扫描模式：多反应监测 (MRM)时间程序：见“细胞培养上清液方法包”驻留时间：4.0-97.0 ms质谱条件分析仪器：r：LCMS-8045化合物：见表1 离子源： ESI， 正负离子同时扫描 离子源接口电压：+4.0kV；-3.0kV 雾化气：氮气3.0 L/min MRM参数：见“细胞培养上清液方法包” 1.3培养基 三种用于抗体药物生产的培养基分别为：1#培养基、2#培养基和3#培养基。 1.4数据处理 软件： LabSolutions Traverse MS 1.5样品制备 样品前处理方法：取500 pL 细胞培养液，在室温下离心1分钟(3000 rpm)， 吸取 100 uL离心后上清液到新的离心管中，然后加入20 puL2-异丙基苹果酸内标溶液(0.5 mmol/L)， 再加入200 uL乙腈，涡旋使充分混匀，室温下离心15分钟(15000 rpm)，精密吸取上清液100pL， 加入 900 uL水，涡旋混匀，上机前再用纯水稀释10倍。 表1组细胞培养上清液方法包中96种化合物列表 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 编号 化合物名 类别 1 2-Isopropylmalic acid 内标 33 N-Acetylaspartic acid 氨基酸 65 Cytidine 核苷酸 2 Gluconic acid 糖类 34 N-Acetylcysteine 氨基酸 66 Cytidine monophosphate 核苷酸 3 Glucosamine Carbohydrate 糖类 35 Ornithine 氨基酸 67 Deoxycytidine 核苷酸 4 Hexose (Glucose) Carbohydrate 糖类 36 Oxidized glutathione 氨基酸 68 Guanine 核苷酸 5 Sucrose Carbohydrate 糖类 37 Phenylalanine 氨基酸 69 Guanosine 核苷酸 6 Threonic acid Carbohydrate 糖类 38 Pipecolic acid 氨基酸 70 Guanosine monophosphate 核苷酸 7 2-Aminoadipic acid 氨基酸 39 Proline 氨基酸 71 Hypoxanthine 核苷酸 8 4-Aminobutyric acid 氨基酸 40 Serine 氨基酸 72 Inosine 核苷酸 9 4-Hydroxyproline 氨基酸 41 Threonine 氨基酸 73 Thymidine 核苷酸 10 5-Glutamylcysteine 氨基酸 42 Tryptophan 氨基酸 74 Thymine 核苷酸 11 5-Oxoproline 氨基酸 43 Tyrosine 氨基酸 75 Uracil 核苷酸 12 Alanine 氨基酸 44 Valine 氨基酸 76 Uric acid 核苷酸 13 Alanyl-glutamine 氨基酸 45 4-Aminobenzoic acid 维生素 77 Uridine 核苷酸 14 Arginine 氨基酸 46 Ascorbic acid 维生素 78 Xanthine 核苷酸 15 Asparagine 氨基酸 47 Ascorbic acid 2-phosphate 维生素 79 Xanthosine 核苷酸 16 Aspartic acid 氨基酸 48 Biotin 维生素 80 Penicillin G 抗生素 17 Citrulline 氨基酸 49 Choline 维生素 81 2-Aminoethanol 其他 18 Cystathionine 氨基酸 50 Cyanocobalamin 维生素 82 2-Ketoisovaleric acid 其他 19 Cysteine 氨基酸 51 Ergocalciferol 维生素 83 3-Methyl-2-oxovaleric acid 其他 20 Cystine 氨基酸 52 Folic acid 维生素 84 4-Hydroxyphenyllactic acid 其他 21 Glutamic acid 氨基酸 53 Folinic acid 维生素 85 Citric acid 其他 22 Glutamine 氨基酸 54 Lipoic acid 维生素 86 Ethylenediamine 其他 23 Glutathione 氨基酸 55 Niacinamide 维生素 87 Fumaric acid 其他 24 Glycine 氨基酸 56 Nicotinic acid 维生素 88 Glyceric acid 其他 25 Glycyl-glutamine 氨基酸 57 Pantothenic acid 维生素 89 Histamine 其他 26 Histidine 氨基酸 58 Pyridoxal 维生素 90 Isocitric acid 其他 27 Isoleucine 氨基酸 59 Pyridoxine 维生素 91 Lactic acid 其他 28 Kynurenine 氨基酸 60 结果讨论 2.1用于抗体药物生产的培养基组分分析色谱图 使用“细胞培养上清液方法包”中的方法对用于抗体药物生产的培养基中组分进行分析，目标组分不同程度被检出，色谱图如图1所示。 图11#培养基上清液分析色谱图 2.2三种用于抗体药物生产的培养基中部分氨基酸、维生素和其他类化合物的含量差异 2.2.1氨基酸类化合物 图23种用于抗体药物生产的培养基中部分氨基酸类化合物的相对含量差异 2.2.2维生素类化合物 图333种用于抗体药物生产的培养基中部分维生素类化合物的相对含量差异 2.2.3其他类化合物 图433种用于抗体药物生产的培养基中其他类化合物的相对含量差异 图2-4中纵坐标为峰面积比，横坐标代表3个培养基样品。结果显示1#和2#培养基中每个对应的氨基酸、维生素和其他类化合物的峰面积比相差不大，表明这两个培养基组成以及比例相近，而3#培养基样品样1#和2#相差比较大。 结论 采用岛津公司 LCMS-8045三重四极杆液质联用仪分析3种用于抗体药物生产的动物细胞培养基中95种组分相对含量之间的差异。利用岛津“细胞培养上清液方法包”快速分析了3种培养基中95种化合物的相对含量，并对培养基中糖类、氨基酸类和其他类化合物在3种培养基中的分布情况以图表的形式进行了详细说明。 田岛津全球应用技术开发支持中心 利用岛津“细胞培养分析方法包”同时分析培养基中95种化合物的相对含量，一针样品检测仅需17分钟，快速准确。