氨基酸中柱前衍生分析方法精密度及准确度检测方案(液相色谱仪)

SHIMADZUAPPLICATION NEWS色谱分析NO.LC-005http：//www.shimadzu.com.cn岛津应用技术咨询电话(分析中心)上海(021)64156604 广州(020)87108613北京(010)85252416/2417/2352 LC-2010的柱前衍生氨基酸分析 摘要 柱前衍生氨基酸分析是先将氨基酸衍生成具有可见光吸收或荧光发射的衍生物，然后在反相柱上分离，它不需要柱后反应装置，因此也可以在配有相应检测器的普通高效液相色谱仪上分析。为了解LC-2010高效液相色谱仪在使用柱前衍生法进行氨基酸分析时的精密度和稳定性，我们作了以下实验。 HPLC分析条件 置1小时 仪器： LC-2010系统 色谱柱：：shim-pack VP-ODS(4.6mmIDx150mmL)柱温： 36℃流动相：A10mM磷酸缓冲盐(pH=6.9)B乙腈A/B=85/151mL/min 流动相梯度洗脱程序： TIMEFUNCVALUE30.00B.CONC6430.01B.CONC10034.00B.CONC10034.01B.CONC1540.00ControllerSTOP 检测波长：254nm 样品：2.00cmol/mL标准氨基酸液(中国农业科学院分析测试中心研制，17种组分) 进样体积：4o_ 柱前衍生步骤 1、200L样品中加入100mM异硫氰酸苯酯(乙腈溶液)100L和1M三乙胺(乙腈溶液)100L，室温下放 2、反应液中加入400L己烷，振荡 3、.青静置后，取下层液，一次性过滤器(0.45um)过滤 4、取滤液4odL注入HPLC 采用上述步骤同批衍生了10个样品 精密度试验： 取同一份样品，连续测定6次，色谱图如图1。各组分保留时间RSD的最小值为0.057%(Lys)， 最大值为0.291%(Pro)，各组分面积的RSD最小值为0.139%(Lle)，最大值为 1.44%(Cys)， 见表1。 稳定性试验： 取10份样品，连续进样测定，色谱图如图2。各组分保留时间RSD的最小值为0.316%(Phe)，最大值为1.98%(Glu)，各组分面积的RSD 最小值为 4.508%(Tyr)，最大值为 13.821%(Asp)， 见表2。 结果讨论： 1、精密度试验中，各组分保留时间的RSD<0.5%，峰面积的RSD<1.5%。由此数据说明，本次试验中，LC-2010系统的精密度比较好。 2、·、稳定性试验中，通过峰面积的RSD， 可以看到，Asp和Glu的稳定性不是太好，考虑到精密度试验的结果，这个差距应该是由于衍生试验的误差引起的。 图1精密度试验 图2稳定性试验 表1精密度试验 Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 0.225 0.626 Glu 0.237 0.544 Ser 0.213 0.451 Gly 0.208 0.541 His 0.211 0.397 Arg 0.256 0.462 Thr 0.271 1.248 Ala 0.277 0.472 Pro 0.291 0.379 Tyr 0.187 0.247 Val 0.155 0.181 Met 0.146 0.41 Cys 0.107 1.44 lle 0.082 0.139 Leu 0.075 0.241 Phe 0.059 0.388 Lys 0.057 0.439 3、除去最先进样的两个样品，重新统计了保留时间和峰面积的RSD， 见表3，可以看出，峰面积的重复性没有变化，但是保留 时间的重现性得到了一定程度的提高。我们认为，由于分析第一和第二个样品时，系统尚未完全稳定，导致了保留时间的漂移。 表2稳定性试验 Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 1.975 13.821 Glu 1.98 6.641 Ser 0.978 7.139 Gly 0.914 7.429 His 0.809 6.585 Arg 0.564 6.148 Thr 0.769 8.697 Ala 0.742 6.851 Pro 0.701 7.222 Tyr 0.491 4.508 Val 0.457 5.867 Met 0.417 5.428 Cys 0.45 6.675 lle 0.349 5.5 Leu 0.338 5.229 Phe 0.316 5.378 Lys 0.322 6.545 表3稳定性试验 Name Retention time Area %RSD %RSD Asp 1.535 15.547 Glu 1.408 6.997 Ser 0.514 7.455 Gly 0.457 7.907 His 0.384 6.981 Arg 0.3 6.443 Thr 0.386 9.184 Ala 0.395 7.332 Pro 0.368 7.664 Tyr 0.3 4.611 Val 0.273 6.22 Met 0.254 5.697 Cys 0.237 6.753 lle 0.183 5.756 Leu 0.175 5.223 Phe 0.164 5.787 Lys 0.168 6.927