牛奶中黄曲霉毒素M1检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA14-567Excellence in Science Excellence in ScienceLC-163 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 应用真菌毒素筛查系统测定牛奶中的黄曲霉毒素M1 LC-163 摘要：本文建立了一种使用岛津 i-Series 方法包霉菌毒素筛查系统对牛奶中的黄曲霉毒素M1 进行检测的方法。实验结果表明：该方法该性范围宽，在0.1 ug/L~ 20 ug/L 浓度范围内线性良好，相关系数大于0.999。0.2 ug/L、1 ug/L和10 ug/L 三个浓度标样6次连续进样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.12~0.22%和0.08~1.83%之间，仪器精密度良好；牛奶样品加标回收率大于97%。经验证，采用真菌筛查系统检测 AFM1 简便、快速、准确。 关键词： i-Series方法包真菌毒素筛查系统牛奶黄曲霉毒素 M1 免疫亲和柱 黄曲霉毒素M1(AFM1)是由常见的黄曲霉和寄生曲霉产生的代谢产物。哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素B1(AFB1)污染的饲料和食物后，部分AFB1在体内转化成 AFM1， 存在于动物分泌的乳汁和产生的尿液中，为强致癌剂。美国和日本规定乳及乳制品中 AFM1 含量不得超过 0.5 ug/kg；欧盟规定鲜乳中 AFM1 含量不能超过 0.05 pg/kg； 我国规定牛乳中含量不得超过 0.5 ug/kg。 免疫亲和柱能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒 素，而让其它杂质通过柱子，使样品得以纯化。吸附后的黄曲霉毒素可被极性有机溶剂洗脱。免疫亲和柱将提取、净化、浓缩一次完成，操作简便，净化效果好，提高了方法的准确度、精密度和灵敏度。 本文采用岛津推出的 i-Series 方法包霉菌毒素筛查系统对牛奶中的黄曲霉毒素M1 进行检测。本筛选系统是将体积小且操作简便的一体化 HPLC“i-Series”与含预处理方法在内的分析方法组合使用，本试验可为相关检测人员提供参考。 1.1 仪器和试剂 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 Nexera-i 系统。具体配置为： LC-2040C 3D， RF-20Axs 荧光检测器，LabSolutions Ver. 5.89 色谱工作站， i-Series 方法包(霉菌毒素筛查系统)，黄曲霉毒素M1 标准品(0.5 mg/L， RomerLabs)， AflaStarTM R(Romer Labs) 黄曲霉毒素免疫亲和柱。 1.2分析条件 液相色谱条件进样体积： 10 pL色谱柱： Shim-pack GIST C18 (3.0 mm I.D.x柱温：55℃75 mmL.，2 um)检测波长： Ex=365 nm， Em=450 nm流动相：A相-20 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH2.5)，洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，洗脱B相-乙腈，C相-甲醇程序见表1。 流速：1.0 mL/min 表1：梯度洗脱程序 0 B(%) C(%) 0.00 0 1.3样品制备 1.3.1标准溶液配制 用流动相初始比例乙腈水溶液将标准储备液(0.5 mg/L) 逐级稀释成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 ug/L 等8个标准溶液浓度系列。 1.3.2样品前处理方法 ①试样的制备 将牛奶加热至37℃，趁热用玻璃纤维滤纸过滤样品。生乳等含脂肪的样品需均质化后再离心处理(2000 rpm 以上，15分钟)后，去除上层的脂肪层。下层的液体再用玻璃纤维滤纸过滤，作为样品。 ②试样的提取和净化 将黄曲霉毒素免疫亲和小柱放于室温至恒温，弃掉柱内剩余保护液；用 pH7.0 的 PBS溶液平衡小柱(3mLx3)；收集试样制备得到的乳液20 g，过黄曲霉毒素免疫亲和小柱；用3mL水洗柱，并再重复4次，抽干小柱；用1mL乙腈洗柱，并再重复2次，收集全部洗脱液于离心管中；在50℃下用氮吹仪以氮气吹干，残留物用1mL初始流动相复溶，10000 rpm 离心15分钟后取上清液进样分析。 结果与讨论 2.1标准样品的色谱图 标准样品色谱图如图1所示。AFM1 保留时间为5.353 min。 图11黄曲霉毒素M1标准样品色谱图(1.0 ug/L) 2.2线性关系 将8个不同浓度的黄曲霉毒素标准工作溶液，按1.2中的分析条件进行测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，结果如图2所示。线性方程为￥=(3631.65)X +(-6.03976)线性范围 0.1~20 ug/L， 相关系数大于0.9998，线性良好。 图2黄曲霉毒素M1的标准工作曲线 2.3精密度实验 取低、中、高三个不同浓度标准溶液，分别平行进样6次，目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.12~0.22%和0.08~1.83%之间，仪器精密度良好。 表2保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 浓度(ug/L)保留时间RSD 峰面积RSD 0.2 0.12% 1.83% 1 0.22% 0.39% 10 0.19% 0.08% 2.4加标回收实验 按照1.3所述方法处理全程序空白样品(除不加样品外，其他步骤和实际样品的处理相同)、市售纯牛奶样品，上机测试。全程序空白样品色谱图如图3所示。纯牛奶样品色谱图如图4所示。纯牛奶样品加标色谱图如图6、图7所示。加标回收结果见表3。 图3全程序空白样品的色谱图 图4纯牛奶样品的色谱图 图5纯牛奶加标样品的色谱图(加标量：0.05pg/kg) 图6纯牛奶加标样品的色谱图(加标量：0.5 pg/kg) 表3加标回收结果(n=3) 基质 样品 加标量 平均回收率 RSD ug/kg ug/kg 牛奶 N.D. 0.05 97.0% 5.33% 0.50 98.3% 2.51% 注： N.D.表示未检出 结论 本文建立了一种使用使用岛津 i-Series 方法包霉菌毒素筛查系统对牛奶中的黄曲霉毒素M1 进行检测的方法。实验结果表明：该方法线性范围宽，在0.1ug/L~ 20 ug/L 浓度范围内线性良好，相关系数大于 0.999。0.2 ug/L、1 ug/L和 10 ug/L 三个浓度标样6次连续进样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在 0.12~0.22%和0.08~1.83%之间，仪器精密度良好；牛奶样品加标回收率大于97%。本方法适合作为乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的快速分析。 附录： 表4黄曲霉毒素M1化合物信息表 中文名称 英文名称 CAS号 黄曲霉毒素M1 Aflatoxin M1 6795-23-9 岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种使用岛津i-Series方法包霉菌毒素筛查系统对牛奶中的黄曲霉毒素M1进行检测的方法。实验结果表明：该方法线性范围宽，在0.1 μg/L~ 20 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数大于0.999。0.2 μg/L、1 μg/L和10 μg/L 三个浓度标样6次连续进样的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.12~0.22%和0.08~1.83%之间，仪器精密度良好；牛奶样品加标回收率大于97%。经验证，采用真菌筛查系统检测AFM1简便、快速、准确。