尿液中依诺沙星检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-377Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-261 咨询电话：021-22013542上海市淮海西路570号红坊E楼http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定尿液中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留 LCMSMS-261 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四重杆质谱仪 LCMS-8060 联用测定尿液中磺胺类、喹诺酮类抗生素的方法。该方法在 12 min 内完成 28种抗生素的分析，磺胺类和喹诺酮类的校准曲线的相关系数均在 0.997 以上。对 1 ng/mL 抗生素的混合标准溶液，平行测试6次，28种目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.08%和 0.48~4.48%之间，仪器精密度良好。灵敏度考察结果表明，28种抗生素的定量限在 0.006~0.672 ng/mL 的范围内。该方法可用于尿液中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留的同时检测。 关键词：：三重四极杆质谱 磺胺喹诺酮尿液 磺胺类药物 (Sulfonamides， SAs)、喹诺酮类药物(Quinolones， QNs)是家禽养殖中常用的两类药物，因其具有高效、价格低廉等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中。但过量使用有可能在动物或人体内蓄积，对人体有害，并导致病原体产生耐药性。因此，国际食品法典委员会(CAC)、美国、欧盟、日本及我国都规定食品中SAs药物总量以及磺胺二甲基嘧啶等单个磺胺的最大残留限量(MRLs)为100 ug/kg；根据不同品种、组织和药物种类，食品中QNs药物的MRLs为10~6000 pg/kg. 目前针对动物源性食品中禁用药物的检测主要集中动物组织、奶制品等。由于大部分兽药都是通过尿液排出体外，通过检测 实验部分 尿液中药物的残留量可减少对动物活体的影响，也可以从养殖源头控制禁用药物流入食品，但尿液中的兽药原药浓度往往较低，给检测过程带来很大困难。 磺胺类药物、喹诺酮类药物的测定方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱联用法。其中液相色谱-串联质谱法由于其检出限低、灵敏度高、可以准确定性等优点，成为检测此类物质的首选。本文利用岛津液质系统 LCMS-8060 开展了尿液中28种磺胺类、喹诺酮类抗生素的检测，尿液经缓冲溶液调节pH值后，使用 HLB固相萃取小柱进行净化浓缩，然后使用 UHPLC-MS/MS 检测，方法简单、快速、灵敏度高，适用于尿液中的多种抗生素残留检测。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用系统。具体配置为LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-30AC柱温箱， CBM-20A 系统控制器， LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions LCMSMS-261Ver. 5.86色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mm I.D.x 100 mm L.， 2 pm 流动相：A相-0.1%甲酸水溶液 B相-甲醇 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 进样量：10pL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 6.00 Pumps Pump B Conc. 60 7.00 Pumps Pump B Conc. 80 7.50 Pumps Pump B Conc. 80 7.51 Pumps Pump B Conc. 10 12.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器：LCMS-8060源温度：：3300℃离子化模式： ESI(+)DL温度：250℃加热气：空气10.0L/min加热模块温度：400℃雾化气：多氮气 3.0 L/min扫描模式：多多反应监测(MRM)干燥气： 氮气10.0L/min延迟时间：3 ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2MRM优化参数 NO 化合物 英文名 CAS No. 前体离 产物离 Q1 Pre CE Q3 Pre 子 子 Bias (V) (V) Bias (V) 1 磺胺胍 Sulfaguanidine 57-67-0 215.0 156.0* -10 -11 -11 108.0 -10 -19 -20 2 磺胺醋酰 Sulfacetamide 144-80-9 215.1 156.0* -10 -11 -29 92.1 -10 -23 -17 3 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 68-35-9 251.0 156.0* -12 -15 -10 92.1 -12 -27 -17 92.0 -30 -28 -17 22 沙拉沙星 Sarafloxacin 98105-99-8 386.0 368.0* -11 -24 -27 299.0 -14 -27 -21 156.0* -12 -18 -16 23 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine 1220-83-3 281.0 108.0 -23 -18 -22 24 729-99-7 268.1 156.1* -30 -15 -29 磺胺恶唑 Sulfamoxole 113.1 -30 -22 -21 25 磺胺二甲基异噁唑 Sulfisoxazole 127-69-5 268.0 156.0* -30 -13 -16 92.1 -30 -27 -17 26 磺胺邻二甲氧嘧啶 Sulfadoxine 2447-57-6 311.0 156.0* -28 -26 -16 108.0 -30 -30 -19 27 磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole 526-08-9 315.1 158.1* -30 -28 -30 156.1 -30 -21 -30 28 磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine 122-11-2 311.0 156.1* -23 -22 -29 92.1 -23 -35 -17 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配制 分别称取抗生素标准品适量，用甲醇溶解、配制成 1.0 mg/mL 的混合标准储备液，置于-18℃冰箱中保存。取准确体积的标样储备液，加入到空白尿液基质中，依次配制不同浓度的混合标准工作液，具体加标浓度见表3. 1.4样品前处理方法 准确量取1mL尿液，加入2mLK2HPO4缓冲液(25mM，pH4.0)，涡旋混匀后以不超过1mL/min 的速度上样至HLB 的SPE小柱(60mg，3mL)，使用前分别用3mL 甲醇、3mL 水和3mL缓冲液活化。然后用3mL 缓冲液和3mL水清洗，将小柱抽干，再用 3mL5%氨化甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液于45℃下用氮气吹干，用1mL流动相定容，漩涡混匀后过0.22um 滤膜，然后进液相色谱-串联质谱测定。 LCMSMS-261 结果与讨论 图1 0.5 ng/mL 28 种抗生素的 MRM 色谱图 2.2线性范围 取1.0 mL空白尿样10份，每份样品按上述萃取和净化过程进行处理，得到10mL基质提取液。用该基质溶液稀释标准储备液，配制成适当浓度的标准工作液。以工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线(见下图2)，所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。 表3校准曲线参数 2.3精密度实验 配制 1.0 ng/mL 抗生素的混合标准溶液，平行测试6次。28种目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~0.08%和0.48~4.48%之间，仪器精密度良好(见表4)。 表4保留时间和峰面积重复性及灵敏度结果 序号 化合物名称 R.T. Area 检出限(ng/mL) 定量限(ng/mL) 磺胺胍 0.05 1.35 0.0038 0.0116 2 磺胺醋酰 0.04 0.48 0.0036 0.0108 3 磺胺嘧啶 0.04 1.38 0.0132 0.0400 4 磺胺噻唑 0.04 2.25 0.0038 0.0114 5 磺胺吡啶 0.05 2.14 0.0048 0.0147 6 磺胺甲基嘧啶 0.05 1.60 0.0029 0.0088 7 氧氟沙星 0.04 1.10 0.0021 0.0063 8 依诺沙星 0.06 3.74 0.0281 0.0850 9 培氟沙星 0.06 3.81 0.0133 0.0443 10 磺胺甲噻二唑 0.04 1.24 0.0281 0.0850 11 磺胺对甲氧嘧啶 0.03 2.26 0.0023 0.0071 12 诺氟沙星 0.08 4.12 0.0494 0.1497 13 磺胺二甲嘧啶 0.02 1.15 0.0018 0.0055 14 磺胺二甲基异嘧啶 0.02 1.76 0.0032 0.0097 15 环丙沙星 0.04 4.48 0.0210 0.0699 16 磺胺甲氧哒嗪 0.03 2.32 0.0025 0.0083 17 恩诺沙星 0.03 1.59 0.0083 0.0277 18 达氟沙星 0.03 4，34 0.2219 0.6723 19 磺胺氯哒嗪 0.02 1.81 0.0049 0.0142 20 双氟沙星 0.04 3.31 0.0021 0.0064 21 磺胺甲噁唑 0.03 1.41 0.0048 0.0145 22 沙拉沙星 0.03 3.26 0.0030 0.0090 23 磺胺间甲氧嘧啶 0.04 0.71 0.0064 0.0210 24 磺胺恶唑 0.03 1.03 0.0047 0.0143 25 磺胺二甲基异噁唑 0.02 1.25 0.0064 0.0194 26 磺胺邻二甲氧嘧啶 0.03 0.76 0.0049 0.0148 27 磺胺苯吡唑 0.02 0.63 0.0024 0.0074 28 磺胺间二甲氧嘧啶 0.03 0.58 0.0023 0.0070 2.4灵敏度实验 配制0.5 ng/mL 抗生素的混合标准溶液进样，根据检出限 MDL=3.3 S/N， 定量限LOQ=10 S/N 计算检出限和定量限，结果如表4所示。 2.5基质加标实验 按照1.4中样品制备方法，加标浓度为 0.5 ng/mL 和 5 ng/mL， 平行测定3次。测试结果显示：28种抗生素样品的加标回收率在89.6~116.9%之间，具体结果如表 5. 表5基质加标实验结果 序号 名称 加标浓度 0.5 ng/mL 加标浓度 5 ng/mL 检测平均值 回收率% 检测平均值 回收率% (ng/mL) (ng/mL) 磺胺胍 0.54 108.8 4.92 98.5 2 磺胺醋酰 0.56 111.0 4.97 99.5 3 磺胺嘧啶 0.52 104.0 5.20 103.9 4 磺胺噻唑 0.51 102.6 4.90 98.0 5 磺胺吡啶 0.53 105.6 4.87 97.5 6 磺胺甲基嘧啶 0.52 103.6 4.99 99.9 7 氧氟沙星 0.49 98.0 4.89 97.8 8 依诺沙星 0.56 112.6 5.84 116.9 9 培氟沙星 0.51 101.8 4.98 99.7 10 磺胺甲噻二唑 0.52 103.4 5.07 101.4 11 磺胺对甲氧嘧啶 0.51 102.4 5.33 106.5 12 诺氟沙星 0.52 103.6 5.045 100.7 13 磺胺二甲嘧啶 0.50 99.6 5.25 105.1 14 磺胺二甲基异嘧啶 0.49 97.8 5.27 105.4 15 环丙沙星 0.52 103.4 4.90 98.1 16 磺胺甲氧哒嗪 0.51 102.6 5.10 102.1 17 恩诺沙星 0.51 102.0 4.89 97.7 18 达氟沙星 0.58 115.6 5.08 101.7 19 磺胺氯哒嗪 0.51 102.0 5.08 101.6 20 双氟沙星 0.45 89.6 4.66 93.1 21 磺胺甲噁唑 0.49 98.6 4.98 99.6 22 沙拉沙星 0.51 102.0 4.91 98.1 23 磺胺间甲氧嘧啶 0.50 99.8 4.92 98.4 24 磺胺恶唑 0.52 104.0 5.03 100.6 25 磺胺二甲基异噁唑 0.52 104.0 4.97 99.5 26 磺胺邻二甲氧嘧啶 0.51 102.8 4.96 99.2 27 磺胺苯吡唑 0.51 102.0 5.05 100.9 28 磺胺间二甲氧嘧啶 0.51 102.0 4.93 98.5 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用测定尿液中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留的方法。该方法在 12 min 内完成28种抗生素的分析，校准曲线的相关系数均在0.997 以上。对 1.0 ng/mL 抗生素的混合标准溶液，平行测试6次，28种目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.02~0.08%和0.48~4.48%之间，仪器精密度良好。对于加标浓度为 0.5 ng/mL 和 5 ng/mL 的尿液样品，平行测定3次，加标回收率在 89.6~116.9%之间。该方法具有分析速度快、灵敏度高、重复性好的优势，可用于尿液中多种抗生素残留检测。 岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用测定尿液中磺胺类、喹诺酮类抗生素的方法。该方法在12 min内完成28种抗生素的分析，磺胺类和喹诺酮类的校准曲线的相关系数均在0.997以上。对1 ng/mL抗生素的混合标准溶液，平行测试6次，28种目标化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02~ 0.08%和0.48~ 4.48%之间，仪器精密度良好。灵敏度考察结果表明，28种抗生素的定量限在0.006~0.672 ng/mL的范围内。该方法可用于尿液中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留的同时检测。