尿液中6种形态砷检测方案(ICP-MS)

SSL-CA19-068Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-108 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Centerhttp：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996 HPLC-ICP-MS 法尿定尿液中的形态砷 CPMS-108 摘要：本文建立了 HPLC-ICP-MS测定尿液中六种形态砷的分析方法。尿液直接离心过滤，使用0.015 mol/LEDTA溶液稀稀，以2%甲醇和50 mmol/L (NH4)2CO3 (pH=8) 作为流动相，采用高效液夜色谱 LC-20Ai对砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱 (AsB)、As (Ⅲ)、二甲基砷(DMA)、·一甲基砷(MMA) 和As(V)六种形态砷进行分离，电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030检测进行定量分析。在优化的测试条件下，六种形态砷在0.1~10ng/mL范围内线性关系良好，相关系数大于 0.9996，加标回收率在92%~104%之间，浓度和保留时间精密度(n=6)分别小于3%和0.1%。该方法可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态的分析。 砷是致癌物质，长期低剂量接触会引起皮肤癌、膀胱癌和肺癌，同时引发神经系统和心血管系统疾病。砷的毒性与其存在形态密切相关，在常见砷的化合物中，亚砷酸盐(As(ⅢI))和砷酸盐(As(V))毒性较大，一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸 (DMA)毒性较小，砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)和砷糖等基本没有毒性。 砷在生物体内会发生代谢、转化、使得砷的形态变得复杂。大量的研究表明，人体经砷暴露后，无机砷(As (ⅢI)和As(V))在体内经过甲基化和还原过程，产生多种甲基化代谢产物，随后经尿液排出。 尿液是易获得的检材，且尿砷是一种较理想的反映近期砷暴露的生物学标志。然而砷化合物的毒性各不相同，总砷含量常常不能正确反映人体经暴露后的代谢情况，所以对不同形态、价态的砷化物进行测定显得尤为重要。 本研究将尿液离心过滤后，，使用0.015mol/LEDTA稀释。采用岛津高效液相色谱 LC-20Ai 与电感耦合等离子体质谱仪ICPMS-2030联用对尿液中砷进行形态分析，定量测定各个形态砷的含量。本方法操作简便，可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。 I实验部分 1.1对照品 砷酸、亚砷酸、一甲基砷、.二甲基砷、砷胆碱、砷甜菜碱购于国家标准物质中心。 1.2实验检材 尿液 1.3仪器 本实验使用岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai 与电感耦合等离子体质谱仪 ICPMS-2030 联用系统。具体配置为LC-20Ai×2输液泵，DGU-20A3在线脱气机， SIL-20AC自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器，ICPMS-2030电感耦合等离子体质谱仪， LabSolutions ICPMS TRM 工作站； AP135W电子天平(日本岛津公司)；Allegra 25R低温高速离心机(美国Beckman) 1.4试剂 乙二胺四乙酸钠(EDTA)、硝酸和碳酸铵均为优级纯，。D甲醇为质谱纯。 I方法和结果 2.1标准溶液配制 精密吸取对照品储备溶液适量，加0.015 mol/LEDTA(pH=8)溶液制成每1mL各含0.1ng、0.5ng、1.0ng、2.5 ng、5.0ng、10.0ng(均以砷计)系列浓度的混合溶液，摇匀，备用。 2.2样品前处理 将尿样置于离心管中，10000 r/min 离心 15 min，经0.45 um微孔滤膜过滤，用0.015 mol/L EDTA (pH=8)溶液稀释20倍后进 HPLC-ICP-MS分析。 2.3色谱条件 色谱条件参见表1、表2。 表 1 HPLC分析条件 参数 参数设定 色谱柱 Hamilton PRP-X100 Anion Exchange 250*4.1mm 流动相 A-2% 甲醇水B-50 mmol/L碳酸铵水溶液 ( (pH=8) 流速 1.5 mL/min 柱温 40°C 进样量 50pL 洗针液 水 洗脱程序 梯度洗脱 表2梯度洗脱条件 Time(min) Flow(mL/min) A.Conc (%) B.Conc(%) 0.00 1.50 100 0.0 2.00 1.50 100 0.0 3.00 1.50 0.0 100.0 8.00 1.50 0.0 100.0 8.10 1.50 100 0.0 15.00 1.50 100 0.0 2.4质谱条件 ICP-MS仪器分析条件见表3。 表 3 ICP-MS分析条件 参数 参数设定 参数 参数设定 高频功率 1.20 kW 等离子体气流速 8.0 L/min 辅助气流速 1.10 L/min 载气流速 0.70 L/min 炬管类型 Mini 管 雾化器 同心雾化器 雾化室 旋流 雾化室温度 5°C 采样深度 5.0mm 高频频率 27.12 MHz |结果与讨论 3.1专属性考察 对空白和六种形态砷溶液进样考察，排除系统干扰，并且考察六种形态砷的分离度，!，以确保实际样品分析过程中不会造成假阳性检出，见图1。 图1砷元素形态及价态测定图谱 1.砷胆碱 (AsC)； 2.砷甜菜碱(AsB)；3.亚砷酸根(As(ⅢI))； 4.二甲基砷(DMA)； 5.一甲基砷(MMA)；6.砷酸根 (As(V )) 3.2线性关系考察 按“2.1标准溶液配制”规定进行标准曲线系列浓度的配制，记录各成分的峰面积，以浓度(浓度均以As计)与峰面积比值做线性回归绘制标准曲线，结果如下所示。 图2砷胆碱标准曲线 r=0.99971 图3砷甜菜碱标准曲线 r=0.99995 图4亚砷酸根标准曲线 r=0.99965 图5二甲基砷标准曲线 r=0.99979 图6一甲基砷标准曲线r=0.99993 图7砷酸根标准曲线 r=0.99988 3.3检出限考察 在进样体积为50uL时，对浓度为 1.0 ng/mL 样品溶液考察六种形态砷的信噪比，以三倍信噪比 (3S/N)峰高对应浓度作为检出限，六种形态砷色谱图、基线及检出限结果分别见图8、图9和表4。 图81.0 ng/mL砷元素形态及价态测定图谱 1.砷胆碱(AsC)；2.砷甜菜碱 (AsB)；3.亚砷酸根 (As(ⅢI))； 4.二甲基砷(DMA)；5.一甲基砷(MMA)； 6.砷酸根 (As(V)) 图9色谱分离基线 表4检出限考察结果 目标物 中文名称 仪器检出限 方法检出限 (ng/mL) (ng/g) AsC 砷胆碱 0.010 0.20 AsB 砷甜菜碱 0.013 0.26 As(Ⅲ) 亚砷酸根 0.024 0.48 DMA 二甲基砷 0.015 0.30 MMA 一甲基砷 0.022 0.44 As(V) 砷酸根 0.041 0.82 3.4样品测试结果及回收率考察 将尿液按“2.2样品的处理方法”i进行处理后进 HPLC-ICP-MS分析，并对尿液样品进行加标回收试验，测定结果见表5。 表5样品测定及回收率考察结果 目标物 中文名称 测定结果 样品换算结果 加标浓度 加标测定结果 回收率(%) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) AsC 砷胆碱 ND ND 0.50 0.46 92 AsB 砷甜菜碱 ND ND 0.50 0.52 104 As(Ⅲ) 亚砷酸根 ND ND 0.50 0.49 98 DMA 二甲基砷 1.35 27 2.00 3.38 102 MMA 一甲基砷 ND ND 0.50 0.49 98 As(V) 砷酸根 ND ND 0.50 0.51 102 3.5精密度考察 取6份样品溶液，各加入2.0 ng/mL的6种形态砷混合标准溶液并重复6次测定，对方法学浓度和保留时间精密度进行考察，结果以RSD% 表示，见表6. 表6浓度及保留时间精密度结果((n=6) 目标物 中文名称 浓度精密度 (RSD%) 保留时间精密度(RSD%) AsC 砷胆碱 0.95 0.04 AsB 砷甜菜碱 0.47 0.10 As(II) 亚砷酸根 0.89 0.10 DMA 二甲基砷 0.40 0.04 MMA 一甲基砷 1.84 0.08 As(V) 砷酸根 2.60 0.05 ■结论 本文建立了 HPLC-ICP-MS 测定尿液中六种形态砷的分析方法。直接离心过滤以 0.015 mol/L EDTA溶液稀释处理样品，以2%甲醇和50 mmol/L (NH4)2CO3(pH=8)作为流动相，采用高效液相色谱 LC-20Ai对砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)、As (Ⅲ)、二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)和As(V)六种形态砷进行分离，电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030 检测进行定量分析。在优化的测试条件下，六种形态砷在0.1~10 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数大于0.9996，加标回收率在92%-104%之间，浓度和保留时间精密度(n=6)分别小于3%和0.1%。该方法操作简便，可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。 Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai 本文建立了HPLC-ICP-MS测定尿液中六种形态砷的分析方法。直接离心过滤以0.015 mol/L EDTA溶液稀释处理样品，以 2% 甲醇和50mmol/L (NH4)2CO3 (pH=8) 作为流动相，采用高效液相色谱LC-20Ai对砷胆碱（AsC）、砷甜菜碱（AsB）、As（Ⅲ）、二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）和As(Ⅴ) 六种形态砷进行分离，电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030检测进行定量分析。在优化的测试条件下，六种形态砷在0.1~10 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.9996，加标回收率在92%-104% 之间，浓度和保留时间精密度（n=6）分别小于3% 和0.1%。该方法操作简便，可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。