山楂药材中金丝桃苷检测方案(液相色谱配件)

2017年第4期第44卷总第342期广东 化 工www.gdchem.com·17· 山楂药材中八种降血脂有效成分的提取与 HPLC 含量测定 罗嘉琪，许滨，长陈雨，梁生旺* (广东药科大学中药学院，国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东高校中药质量工程技术研究中心，广东广州510006) [摘 要]目的建立山楂中牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、素皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的 HPLC 含量测定，同时考察八种成分的最优提取工艺。方法采用正交试验设计考察了提取料液比、提取粉末规格、提取时间三个因素对提取率的影响。使用岛津 InertSustain AQ-C18色谱柱(4.6 mmx250 mm， 5 um)；以甲醇-乙腈-0.5%醋酸铵为流动相梯度洗脱；检测波长360 nm、210nm；柱温25℃；流速0.8mL/min；进样量：20uL。结果最优提取条件为：料液比1：60，提取粉末规格65目，提取时间45 min。牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异桷皮素、皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸平均回收率分别为99.05%(RSD=2.35%)、99.05 %(RSD=1.90%)、100.82%(RSD=2.37%)、101.84%(RSD=1.76%)、99.0%(RSD=2.19%)、99.70%(RSD=1.88%)、98.59%(RSD=1.78%)、98.44%(RSD=1.69%)。结论本实验建立的HPLC 测定方法灵敏、简便、准确、重复性好，可用于山楂药材的质量控制。 [关键词]山楂；降血脂成分；提取； HPLC [中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2017)04-0017-04 Extraction and HPLC Determination of Eight Hypolipidaemic Constituents inCrateagus Luo Jiaqi， Xu bin， Chen Yu， Liang Shengwang (School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University；Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine DigitalizationQuality Evaluation， State Administration of Traditional Chinese Medicine； Research Center for Traditional Chinese Medicine Quality EngineeringTechnology for Guangdong Universities， Guangzhou 510006， China) Abstract： Objective To establish an HPLC method for determining eight hypolipidaemic constituents in Crateagus， and explore the the best extractioncondition of eight constituents . Methods The effects of extraction ratio， extraction size and extraction time on the extraction rate were investigated by orthogonaldesign.HPLC and Shimadzu Inert Sustain AQ-C18 column(4.6 mmx250 mm， 5 um) were adopted， with methanol-acetonitrile-0.5% ammonium acetate as the mobilephase at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 25 ℃， the UV detection wavelength was 360nm and 210nm， and injection volume was 20uL. Result The optimum extraction conditions were as follows： the ratio of material to liquid was 1： 60， the extraction size was 65 mesh， and the extraction time was45 min. Vitexin， rutin， hyperoside， isoquercitrin， quercetin， hawthorn acid， oleanolic acid， and ursolic acid showed good linear relationships within the ranges of0.0242-0.484 pg(r=0.9998)， 0.007-0.14 pg(r=0.9999)， 0.182-3.64 ug(r=0. 9995)， 0.613-12.26 pg(r=0.9997)， 0.0046-0.092 pg(r=0.9994)， 0.0814-1.628 pg(r=0.9999)，0.717-14.34 pg(r=0.0.9996) and 0.935-18.7 ug(r=0.0.9997)， whose average recoveries were 99.05 %，99.05%，100.82%，101.84%，99.0%，99.70 %，98.59% and 98.44 % with the RSDs of 2.35 %， 1.90%，2.37%，1.76%，2.19%，1.88 %，1.78% and 1.69 %， respectively. Conclusion This sensitive， accurate， simple and reproducible method qualifies in the quality control of Crateagus. 根据中国药典记载，山楂是蔷薇科植物山里红 Crataeguspinnatifida Bge. Var： Major N. E. Br： 或山楂 Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果实。具有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂的功能。近年来，山楂在治疗心血管疾病的卓越表现引起了广泛关注[2-5]，在治疗心血管疾病方面具有非常巨大的开发潜力。此外，山楂也是目前中医临床上治疗高血脂症的常用药材。据目前文献报道，山楂主含有机酸、黄酮类、低聚黄烷类、三萜类、甾体类、有机胺类等成分，其中，牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、桷皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸等黄酮类及三萜类成分在山楂降低血脂的作用上能够体现显著的活性17-10。然而，目前中国药典对于山楂的质量控制手段比较简单，尤其对于山楂的含量测定仅采用了酸碱滴定的方法检测，并以总有机酸含量不少于5.0%为质量合格标准。虽然目前对于山楂的有效成分含量测定的文献报道亦非常多，但尚未见能同时测定黄酮类与三萜类成分的报道，且多数也缺乏药材提取条件的考察，这显然不能对山楂药材质量达到全面有效的控制。因此，本实验采用正交试验设计考察了提取料液比、粉末规格、提取时间三个因素对提取率的影响，同时建立HPLC 含量测定方法对山楂中八种有效成分进行测定，以其八种成分的提取总量为评价指标，得出最优提取条件。 1仪器与试剂 LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津)； SPD-M20A 二极管阵列紫紫检卜检； Sartorius 1/10万电子分析天平； DK-S24数显恒温 水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。 提取用甲醇、乙醇(广州化学试剂厂)为分析纯，液相用甲醇、乙腈(欧普森)为色谱纯，水为超纯水。山楂药材采购于北京同仁堂药店，经广东药科大学中药学院中药资源系马洪雁副教授鉴定为蔷薇科植物山里红 Crataegus pinnatifida Bge. Var： Major N. E. Br.的干燥成熟果实。对照品由中国食品药品检定研究院提供，牡荆(批号：111687-200602)、皮素(号100080.201402)金丝排果酸(批号：110709-201206)、熊果酸(批号：110742-201421)。异皮素对照品(批号：MUST-13021811)购买于成都曼思特生物科技有限公司，山楂酸对照品(批号：151110)购买于广州齐云生物技术有限公司，经测定含量均大于98%。 2实验方法及结果 2.1色谱条件与系统适用性试验1 牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异桷皮素、桷皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸八种成分的分析采用岛津 InertSustain AQ-C18色谱柱(4.6 mmx250 mm，5 pm)；流动相：A：甲醇B：乙乙C： 0.5%醋酸铵溶液，按下表(表1)程序进行梯度洗脱；检测波长360nm(0-80 min)、210 nm(80-105 min)；柱温25℃；流速0.8 mL/min；进样量：20pL。 ( 「收稿日期1 2017-01-18 ) ( [作者简介] 罗嘉琪(1991-) ， 女，广州人，硕士研究生，主要研究方向为中药质量控制。 ) ( *为通讯作者： 梁 生旺(1954 - )，男，教授，博士生导师，研究方向为中药质量控制。 ) 表1梯度洗脱程序 Tab.1Gradient procedure 时间/min 流动相A/% 流动相 B/% 流动相C/% 0-5 0 10 5-10 0 15 10-44 0 15 44-49 0 49-62 0 62-67 12 67-105 12 21 2.2溶液制备 2.2.1对照品溶液 精密称取牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、皮素、山桂酸、齐墩果酸、熊果酸适量，甲醇溶解，制成含牡荆素(24.2ml)、金丝82.0nemt.)异613.0ug/mL)、熊果酸(93.5 ug/mL)的对照品储备液。 2.2.2供试品溶液 2.2.2.1提取条件的考察 采用正交试验设计，考察提取料液比(A)、提取粉末规格(B)、提取时间(C)三个因素对样品中牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸提取率的影响，以优选出最佳条件。因素水平见表2。 表22因素水平 Tab.2 Factors and levels 因素 水平 A B C 提取料液比 提取粉末规格/目 提取时间/min 1：20 24 45 2 1：40 65 60 3 1 ：60 100 90 按Lg(3")正交表进行试验，精密称取山楂粉末 1.0 g， 加入甲醇，称定重量后加热回流一定时间，取出，放冷至室温后补足重量，过滤，取20 mL续滤液，蒸干，甲醇定容至5 mL量瓶中，摇匀，0.45 um 微孔滤膜滤过，得1~9号供试品溶液。在2.1项色谱条件下，测定八个成分的总含量。结果见表3和表4。 表35.正交试验结果 Tab.3Results of orthogonal tests 编号 A B C 八种成分 提取料液比 提取粉末规格/目 提取时间/min 总含量/% 1 20 24 45 0.1250 2 20 65 60 0.2938 3 20 100 90 0.1719 4 40 24 60 0.1109 5 40 65 90 0.2812 6 40 100 45 0.1913 7 60 24 90 0.1404 8 60 65 45 0.3772 9 60 100 60 0.2328 K 0.1969 0.1254 0.2312 K2 0.1945 0.3174 0.2125 K3 0.2501 0.1987 0.1978 R 0.0532 0.1187 0.0333 表4方差分析 Tab.4 Analysis of variance 方差来源 SS MS F 显著性 A 0.0464 0.003 0.375 B 0.056 0.028 3.500 C 0.002 0.001 0.125 D(误差) 0.006 0.00075 注： F0.01(2，8)=3.11 由直观分析结果可知，各因素影响八种成分总含量的顺序依次为B>A>C。方差分析结果表明，因素B影响最显著，是影响提取率的重要因素。根据极差分析结果(表3)， A取A3， B 取 B2，C取C。因此最佳条件为A；B2C，具体如下。 精密称取山楂粉末(65目)1.0 g，加入甲醇60 mL， 称定重量后加热回流45 min， 取出，放冷至室温后补足重量，过滤，取20mL续滤液，蒸干，甲醇定容至5 mL量瓶中，摇匀，0.45 um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 按上述最佳提取条件，制备供试品溶液，共3份，在2.1项色谱条件下进样，测得八个成分的平均总含量为0.3740%， RSD值为1.11%，表明该提取方法稳定可行。 2.3线性关系考察 精密量取适量按2.2.1项下配制好的八种成分的混合对照品溶液，置于不同体积的容量瓶中。加入甲醇以取得相当于储备液0.4倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍的混合对照品溶液。随后，分别将以上制备好的5个不同浓度的对照品溶液按2.1项色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)对进样量(ug，X)回归，得标准曲线方程及线性范围如下表(表5)所示。由此可见，牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸分别在 0.0242-0.484pg、0.007-0.14 pg、0.182-3.64 pg、0.613-12.26 pg、0.0046-0.092 ng、0.0814-1.628 ug、0.717-14.34 ug、0.935-18.7 ug范围内呈良好线性关系。 表5线性关系考察结果 Tab.55Results of linear relationship 成分 标准曲线方程 线性范围/ug 牡荆素 Y=2583657.708X+1323.5208 0.0242-0.484 0.9998 芦丁 Y=1573777.381X-3624.4917 0.007-0.14 0.9999 金丝桃苷 Y=2162982.99X-116325.1292 0.182-3.64 0.9995 异槲皮素 Y=2309536.562X-260445.7875 0.613-12.26 0.9997 皮素 Y=5029770.833X-8795.6208 0.0046-0.092 0.9994 山楂酸 Y=345846X-1290.7 0.0814-1.628 0.9999 齐墩果酸 Y=393490X+49704 0.717-14.34 0.9996 熊果酸 Y=349086X+69265 0.935-18.7 0.9997 2.4精密度考察 取2.2.1项下对照品溶液，按2.1项色谱条件下连续测定6次。结果牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异榭皮素、皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的峰面积 RSD 分别为 0.39%、0.56%、0.31%、0.33%、0.86%、0.89%、0.42%、0.48%，表明仪器精密度良好。 2.5稳定性考察 按2.2.2项下的最优提取条件，制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下于0、2、4、8、12、24h进样。结果牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、桷皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的峰面积 RSD 分别为 0.66%、1.83%、0.38%、0.37%、1.57%、2.29%、1.04%、0.58%，表明供试品溶液在24h内稳定。 2.6重复性考察 按2.2.2项下的最优提取条件，取6份山楂粉末(65目)，制备供试品溶液6份。在2.1项色谱条件下测定。结果，牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、桷皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的峰面积RSD 分别为1.64%、1.17%、1.76%、1.64%、2.82%、2.80%、1.00%、0.85%，表明该方法重复性良好。 2.7加样回收率考察 按2.2.2项下的最优提取条件，制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定山楂药材中八种成分的含量。其后，取6份山楂粉末，根据其中八种成分的含量，精密加入相应的对照品，制备供试品溶液并测定，结果见表6。 表6八种成分加样回收率试验结果 Tab.6 Results of recovery tests for eight constituents 2.8含量测定 3讨论 取3份山楂药材粉末(65目)，按2.2.2项下的最优提取条件，制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下测定，八个混合标准品与山楂样品液相色谱图见图1、图2。结果，牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异皮素、皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸的平均含量分别为0.0018%、0.0013 %、0.0215%、0.0781%、0.0004%、0.0146%、0.0618%、0.3453%， RSD 为0.28%、0.30%、1.46%、2.04 %、0.27%、2.11%、0.67%、1.09%。 根据研究报道可知，目前认为对山楂中的降血脂有效成分主要是黄酮类及三萜类物质，本实验挑选牡荆素、芦丁、金丝桃苷、异檞皮素、桷皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸八种有效成分作为含量测定的对象。在建立 HPLC 测定方法时，通过流动相的选释，发现八个测定对象在甲醇-乙腈-0.5%醋酸铵梯度洗脱下能够得到理想的分离效果，分离度均达1.5以上。另外通过正交试验法考察提取料液比、提取粉末规格、提取时间对提取率的影响， 确定最佳提取条件，有效保证了八种成分能够被完全提取，从而 实验建立的 HPLC 测定方法准确、稳定、简便易行、灵敏度高，保证了含量测定的准确性。然后，通过方法学考察，能够确定本 故可用于山楂药材饮片的质量评价。 图1八个成分标准品液相色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of eight standard substances 1.牡荆素；2.芦丁；3.金丝桃苷；4.异皮素；5.檞皮素；6.山楂酸；7.齐墩果酸；8.熊果酸 图2山楂样品液相色谱图 Fig.2 HPLC chromatograms of Crateagus sample ( 参考文献 ) ( [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典： -部[S ] .北京：中国医药科 技出版社，2015：31. ) ( [2]Shanti S， P arasakthy K， Deepalakshmi P D， et al . 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