药物中成分分析检测方案(液相色谱柱)

ApplicationNote： 63194 C 结果与讨论 利用UHPLC-PDA 30秒分离检测药物成分 Guifeng Jiang， Yenny Chan， Andre J. Nohl， 赛默飞世尔科技，美国加利福尼亚州San Jose 前言 光电二极管阵列(PDA)是将多个光电二极管在集成电路(IC)芯片上组成非连续的线性阵列。它是一个通用型的HPLC检测器，能记录快速通过样品流动池的样品在整个紫外可见波长范围内的吸收光谱图。 实现高通量分析是现代高速液相色谱发展的主要方向。超高效液相色谱要求检测器实现快速的扫描和数据采集，获得足够多的数据点来定义色谱峰，实现可重复的定量分析。采用粒径小于2 pm的色谱柱和高流速， Thermo Scientific UHPLC仪器能实现峰宽小于1秒的测定。80Hz二极管扫描速率的Thermo Scientific AccelaPDA检测器是专门为峰宽范围为0.10到1.0秒的超快速分离而设计的。 本应用文档中展示了配备80 Hz PDA检测器的AccelaTMUHPLC系统，在30秒内超快速分离对乙酰氨基酚、咖啡因、异丙酚和对羟苯甲酸酯。PDA检测器的性能突出表现在其低噪声水平、低漂移、跨越4个数量级的线性范围和高灵敏度。 实验条件 标准溶液配制 尿嘧啶、对乙酰氨基酚、咖啡因、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丁酯和异丙酚购自Sigma-Aldrich (St. Louis， MO， USA) 和Eastman化学公司 (St. Louis， MO， USA)。根据样品的溶解度准确称取一定量的固体标准样品溶于乙腈、甲醇或水中配制成浓度为1 mg/mL的各物质的储备液。将对乙酰氨基酚、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟苯甲酸丁酯按1：1：1：1比例混合，在水中稀释成一系列浓度的标准溶液用于制备校准曲线。 色谱条件 仪器： Thermo Scientific Accela 600 泵 时间 (min) A (%) B(%) pL/min 0.00 90.0 10.0 2500 0.50 5.0 95.0 2500 0.51 90.0 10.0 2500 1.00 90.0 10.0 2500 1.9 um； Thermo Scientific Javelin 色谱柱， Hypersil GOLDTM， 10x2.1 mm， 1.9 um 流速： 2-5 mL/min 流动相： A：水 B：乙腈(ACN) Accela PDA： 光谱扫描范围：190-800nm， 带宽1 nm通道1：260nm，带宽11nm，二极管扫描速率80Hz，数据采样速率80 Hz， 上升时间0秒，除非特别说明，其余都按此参数。 检测器噪声和漂移 噪声和漂移是评价PDA检测器性能至关重要的参数。检测器漂移和噪声采用美国材料与试验协会(ASTM)方法进行测定。 漂移是当恒定流速1000pL/min的100%甲醇通过系统时进行测定的。PDA检测器的漂移值为0.1mAU/h(图1)。 图1：PDA检测器的漂移 噪声水平的降低有利于提高检测器的灵敏度。噪声水平与数据采样速率和上升时间有关。在四个不同数据采样速率(5，20，40，80Hz)和不同的上升时间下测定了噪声水平(图2)。检测器在低数据采样速率和/或高上升时间下运行时PDA检测器的噪声较低。因此，在实际的HPLC分离方法中如果对峰分辨率、峰形和峰宽影响不大，应该设置较低的数据采样速率和/或较高的上升时 图2： PDA检测器在5，20，40和80Hz的数据采用速率和不同上升时间下的噪声 间。全新Thermo Scientific Accela PDA检测器支持数据采样速率和上升时间的独立优化，从而达到最佳检测灵敏度。 数据采用速率优化 超高效色谱需要快速的数据采样速率以便有足够的数据点定义色谱峰。一般说来，每个峰需要大约20个数据点以实现可重复的定量。数据采样速率的优化对于大部分色谱分离都十分重要。低数据采样速率可能导致分辨率差，峰展宽或变形，定量重现性不好。但是，高数据采样速率会导致噪声增高，降低检测灵敏度，并产生不必要的大的数据文件。 LC梯度方法I采用BDS 50 x4.6mm色谱柱(粒径2.4um)在30秒内分离了8种药物小分子，洗脱顺序为尿嘧啶、对乙酰氨基酚、咖啡因、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丁酯和异丙酚(图3)。咖啡因的峰宽在数据采样速率为80 Hz时为0.37秒，整个峰共有37个数据点。在5，20，40和80Hz不同数据采样速率下比较了咖啡因的峰宽、分辨率和峰形。因为没有足够的数据点来定义色谱峰，数据采样速率为5 Hz和20 Hz时，峰宽增加，峰分辨率降低，并有峰扭曲。数据采样速率为40Hz和80Hz时具有相似的峰宽和峰分辨率，说明这两个数据采样速率都适用于此色谱分离。此时选择40Hz的数据采样速率更好，因为其具有较低的噪声水平和较高的灵敏度。 图3：数据采样速率为5，20，40和80Hz时30秒内快速分离药物成分 梯度方法II采用Thermo Scientific HG 10x2.1 mm， 1.9pm粒径的色谱柱在10秒内分离了尿嘧啶、咖啡因、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟苯甲酸丁酯(图4)。尿嘧啶的峰宽为0.166秒。为了更好的说明数据采样速率对分辨率和峰宽的影响，方法有意使咖啡因产生肩峰(峰#2)。此方法中选择80Hz(图4中的嵌入表格)的数据采样速率比20 Hz和40Hz更好。 检测器线性和灵敏度 高通量UHPLC能在数十秒内完成分离，改善灵敏度，从而得到更尖、更高和分辨率更好的峰。图5显示了浓度分别为39 ng/mL 的对乙酰氨基酚、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟苯甲酸丁酯标准样品在80Hz的数据采样速率和0秒上升时间下30秒内得到分离的情况。对乙酰氨基酚、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟苯甲酸丁酯的信噪比分别为3.8，8.4，7.2和5.3。以等于10和3的信噪比分别定义定量检出限(LOQ)和最低检出限(LOD)。基于39 ng/mL浓度水平标准物质的信噪比，确定了四种标准化合物的LOQ和LOD，它们的LOQ在46-101ng/mL范围内，而LOD在14-31 ng/mL范围内(表1) 图5：39 ng/mL的对乙酰氨基酚和对羟苯甲酸酯溶液评估PDA检测器的灵敏度 对乙酰氨基酚 101 31 39-300，000 对羟苯甲酸乙酯 46 14 39-100，000 对羟苯甲酸丙酯 54 16 39-100，000 对羟苯甲酸丁酯 73 21 39-100，000 表1：对乙酰氨基酚和对羟苯甲酸酯的LOQ和LOD 图4：数据采样速率为20，40和80 Hz时10秒内超高效分离对羟苯甲酸酯 建立了对乙酰氨基酚、对羟苯甲酸乙酯、对羟苯甲酸丙酯和对羟苯甲酸丁酯四种化合物在浓度范围为39-300，000ng/mL内的11个浓度水平下的校准曲线(图6)。四种化合物校准曲线的相关系数均达到0.999以上，线性范围达到4个数量级。 结论 Accela PDA检测器要求数据采样速率达到80 Hz以实现UHPLC高通量分离，二极管扫描速率、数据采样速率和上升时间参数可独立设置。本文采用UHPLC仪器、粒径低于2pm的色谱柱，和PDA检测器采集的足够的数据点，定义了一个0.166秒峰宽的色谱峰。PDA检测器具有跨越4个数量级的线性范围和低至ppb (ng/mL)级的灵敏度，确保了UHPLC高通量分析中对低浓度目标化合物的定性和定量。 In addition to theseoffices， Thermo FisherScientific maintainsa networkof represen-tative organizationsthroughout the world. 赛默飞世尔科技 上海 上海浦东新金桥路27号6号楼 电话：86-21-6865 4588 传真： 86-21-64457830 北京 北京市东城区安定门东大街28号 雍和大厦西楼702-715室 电话：86-10-8419 3588 传真：86-10-84193589 广州 广州东风中路410-412号 健力宝大厦3003-3004室 电话：86-20-83487138 传真： 86-20-83486621 服务热线： 8008105118400650 5118 www.thermo.com analyze.cn@thermofisher.com 图6：对乙酰氨基酚和对羟苯甲酸酯在39-300，000 ng/mL浓度范围内的PDA检测器线性 Page Page 光电二极管阵列（PDA）是将多个光电二极管在集成电路（IC）芯片上组成非连续的线性阵列。它是一个通用型的HPLC检测器，能记录快速通过样品流动池的样品在整个紫外可见波长范围内的吸收光谱图。实现高通量分析是现代高速液相色谱发展的主要方向。超高效液相色谱要求检测器实现快速的扫描和数据采集，获得足够多的数据点来定义色谱峰，实现可重复的定量分析。采用粒径小于2 μm的色谱柱和高流速，Thermo Scientific UHPLC仪器能实现峰宽小于1秒的测定。80 Hz二极管扫描速率的Thermo Scientific AccelaPDA检测器是专门为峰宽范围为0.10到1.0秒的超快速分离而设计的。本应用文档中展示了配备80 Hz PDA检测器的Accela™UHPLC系统，在30秒内超快速分离对乙酰氨基酚、咖啡因、异丙酚和对羟苯甲酸酯。PDA检测器的性能突出表现在其低噪声水平、低漂移、跨越4个数量级的线性范围和高灵敏度。