蔬菜、水果中31种有机磷农残检测方案(气质联用仪)

GC/MS内标法同时测定食品中31种有机磷农残的实验方法研究 李永香1，黄勇2，李发生3，房其美1，1，王玉红4，，明佳佳 (1.郑州市疾控中心，，：郑州450053；2.河南省公安刑事科学技术研究所，郑州450003；3.河南省疾控中心，郑州450000；4.郑州市农产品质量检验中心，郑州450000) 主题词：GC/MS内标法混合溶剂提取31种有机磷同时测定方法研究 本文研究了31种有机磷农药的色谱和质谱行为，并根据大量实验结果制定出了GC/MS内标法同时测定该31种农药残留的 GC/MS方法，不仅克服了气相色谱测定农药残留的缺点，也克服了 GC/MS外标法在测定前处理过程、进样过程、仪器状态变化、试剂变化等过程中引进的保留时间漂移等各种无法克服的干扰和误差，在实际样品含量的测定范围内(0-5.0mg/kg)线性良好(相关系数在0.9936-0.9999之间)；全扫描模式仪器定性检出下限(S/N=3，n=5)：1.59×10-13~1.22×10ng之间；仪器定量检出下限(S/N=10，n=5)：5.28×103~4.08×10lng之间；全扫描模式方法定性检出下限(S/N=3，n=5)： 1.99×10mg/kg~1.37×10mg/kg之间；方法定量检出下限(S/N=10，n=5)在： 6.61×10mg/kg~4.78×10?mg/kg之间；对加混标终浓度为 0.5mg/kg样品重复性条件定测定两次，测定结果的绝对误差小于各算术平均值的5.2%-13.5%，内标回收率指示物回收率在72.70%--97.58%之间；不同样品基质中，目标化合物平均回收率在93.76~108.9%之间。 1、试剂和仪器 1.1试剂 分析纯试剂：丙酮、石油醚、环己烷、异辛烷、乙晴、无水硫酸钠、二氯甲烷、氯化钠；分析纯活性炭：用3mol/L盐酸浸泡过夜，抽滤，用水洗至中性，在120℃下烘干备用；标准品溶液：新购自德国某公司；；标准溶液的配制：准确移取有机磷标准溶液，临用时用混合溶剂(环己烷：丙酮：氯仿：异辛烷=5： 2：2：1)稀释成0.20，0.50，1.00，1.50，2.00， 5.00cg/mL 的标准使用液系列，内标采用气代屈、氛代菲，回收率指示物采用氛代蓖，在标准使用液系列中的浓度为 5.00cg/mL。 1.2仪器 GCMS-QP2010气相色谱质谱仪，EI源；粉碎机；组织捣碎机；超声波提取器；电动振荡器；旋转蒸发仪；具塞锥形瓶，250mL；分液漏斗250mL。台式离心机 (4000r/min 以上)； GL--16高速台式离心机(16000r/min以上)；旋涡式振荡器；加样枪(200cd-1000ul； 50od---500od； 5od-40dd；)枪头用前以丙酮处理。 2、试样的制备 2.1粮食样品，经粉碎机粉碎，过40目筛后，备用。 2.2蔬菜和水果样品，丢掉非可食部分后，剁碎或经组织捣碎，制成蔬菜或水果试样。 2.3提取和净化 粮食：称取取样20g，精确至0.001g，置于具塞锥形瓶中，加入内标及回收率指示物各25g，混匀，加入60mL氯仿，避光超声提取30min，有机相经无水硫酸钠过滤入旋转蒸发并中； 残渣用30mL 混合溶剂避光超声提取15min，有机相经无水硫酸钠过滤入旋转蒸发并中；剩余残渣再用30mL氯仿分三次洗涤，合并所有有机相滤液，过无水硫酸钠于旋转蒸发仪上浓缩，用混合溶剂定容至2.5~5.0mL， 4000 r/min 离心3分钟；取上清液0.5-1mL 转入1.5ml一次性离心试管中(预先用丙酮洗过、晾干)，16000 r/min， 高速离心2分钟；取澄清有机相1od 进样。 蔬菜、水果：称取试样10~20g，精确至0.001g，置于具塞锥形瓶中，加入内标及回收率指示物各25cg，混匀，加无水硫酸钠脱水至干燥粉状，以下操作同4.3粮食前处理步骤。 3、气相色谱--质谱仪测定条件及定性定量方法： 3.11色谱条件： 色谱柱：：DB5-MS柱 30m ×0.32mm × 0.25ocm 载气：氦气；进样口温度：270℃；进样方式：不分流进样； 进样时间：1min；进样量：1od；柱流量：1.78ml/min，采用压力控制模式；分流比：10； 升温程序：60℃保持 1.0 min， 以40℃/min 升到110℃，以5.0℃/min 升到190℃，以3C/min 升到210℃，以 5.0℃/min 升到220℃， 以40℃/min 升到265℃保持 5min。 3.2质谱条件： 离子源温度：200℃；接妾温度：250℃；电子轰击能：70eV；检测器电压1.09Kv， 溶剂切除时间：3.0min 检测方式： SCAN(全扫描)，扫描时间段3.50-33.00min，扫描质量范围：40-440；扫描间隔：0.5sec： SIM (选择离子扫描)，扫描时间段、选择离子(见表一)，扫描质量范围：40-440；扫描间隔：0.5sec： 3.3气相色谱--质谱仪定性定量方法： 3.3.1全扫描检测模式定性标准 采用全扫描谱库检索与相应保留时间提取质量色谱图进行特征选择离子定性相结合的方法定性； 3.3.2选择离子检测模式定性标准 按欧盟残留分析要求选确认鉴定点数，相应保留时间下，要求特征离子中，至少3个特征离子的丰度变化，不大于标准的相同离子丰度的±20%。(见表二) 3.3.3定量计算 一般以各自基峰离子作为定量离子，基峰离子噪声高的，选择其它丰度较高噪声相对较低的离子为定量离子。以标准系列浓度为横坐标，标准目标化合物定量离子与相应内标定量离子峰面积比值为纵坐标制作标准曲线；待测目标化合物定量离子峰面积与相应内标定量离子峰面积比值，扣除空白后，与相应目标化合物标准曲线比较定量(见表三)。也可采用单点法定量。 4、样品的测定及分析结果表述： 4.1 测定 吸取1.0-2.0od试剂空白溶液及样品溶液(添加内标)，分别注入 GC/MS中，定性确证有机磷农药 品种后，对定量离子进行峰积分；再分别配制各种浓度的对应标准溶液(添加内标)，分别注入GC/MS中，绘制成标准曲线，将样品测得比值与标准曲线比较定量。或采用单点法定量。 4.2分析结果的表述 X=A×V×1000/m 式中： X----样品中有机磷的含量， mg/kg；A----进样样液中有机磷的含量(由标准曲线查出)， og；V----样品提取液浓缩定容体积， mL； m----样品质量， g。 4.3允许差 按农残分析要求，允许差为20%。 表一选择离子扫描时间通带及选择离子 扫描时间段(min) 扫描间隔 扫描峰号 扫描选择离子 4.50-6.50 0.30sec 1；2；3；4 941411116479109185220136108137134135 8.00-9.50 0.30sec 5；6； 127192164224671369447 12.00-16.00 0.30sec 7；8；9；10；11；12 110156791268788142109 89 112127 1929758223752602311211259360114170 16.01-18.20 0.30sec 13；14；15；16；17 138194236222122179137199 304152882741861421812921531685691204288246123 18.21-22.20 0.30sec 18；19；20；21 109125263 93 12799 55 29027630523318026027717327816997291136121110289 22.30-24.50 0.30sec 22；23；24；25；2627；28；29；30 582131852551461571181291022741219324685145125212106211 24.80-31.00 0.30sec 31；32；33；34 3032172881952311291533841607793104133240236120106 表二内标、回收率指示物和目标化合物定性、定量离子表 中文名称 色谱保留时间 定量用离子 基峰离子 鉴定用离子 参考内标 回收率指示物 内标D8 5.180 136 136 136108 137134135 甲胺磷 5.578 94 94 941411116479 D8 D10 敌百虫 5.847 109 109 109185220 D8 D10 敌敌畏 5.850 109 109 109185220 D8 D10 速灭磷 8.992 127 127 12719267164224 D8 D10 乙酰甲胺磷 9.075 136 136 94 13647 D8 D10 氧化乐果 12.433 110 110 11015679 12687 D8 D10 甲基内吸磷 13.133 88 88 881421097989112 D8 D10 久效磷 14.533 127 127 1271929758223 D8 D10 甲拌磷 14.700 75 75 75260231121 D8 D10 乐果 15.346 87 87 8712593 D8 D10 内吸磷 15.450 88 88 8860114170 D8 D10 己胺磷 16.592 138 138 138194236222122 D8 D10 二嗪农 16.902 179 179 179137 199304152 D8 D10 乙拌磷 17.175 88 88 88274186142 D8 D10 乙嘧硫磷 17.524 181 181 181292153168 56 D8 D10 稻瘟净 17.808 91 91 91204288246123 D8 D10 甲基对硫磷 18.864 109 109 10912526393 D8 D10 马拉氧磷 18.988 127 127 12799 12555 D8 D10 甲基嘧硫磷 19.999 290 290 290276305233180 D8 D10 杀e读蛄 20.000 125 125 125109260277 D8 D10 马拉硫磷 20.554 93 93 9312517399 D12 D10 倍硫磷 20.910 278 278 278169125 D12 D10 对硫磷 21.074 97 97 10997 291 D12 D10 水胺硫磷 21.263 136 136 136121110289 D12 D10 异硫磷 22.768 58 58 58213185255 D12 D10 奎硫磷 23.025 146 146 146118129102298 D12 D10 稻丰散 23.608 274 274 274121246107 D12 D10 杀扑磷 23.844 85 85 851451259358 D12 D10 内标D10 24.942 212 212 212106211213 D12 D10 克线磷 27.503 303 303 303217288195 D12 D10 乙硫磷 28.560 231 231 231129153384 D12 D10 亚胺硫磷 29.858 160 160 1607793104133 D12 D10 内标D12 29.861 240 240 240236120106 结果与讨论： 5.1实验结果见表三、表四、表五、及图一； 5.2表三结果说明，内标、回收率指示物和目标化合物内标法测定曲线线性良好；但实验证实，由于倍硫磷、克线磷、甲基内吸磷、乙拌磷、甲拌磷在混合标准中不稳定，其相应的外标法测定曲线线性却极差；笔者实验证实，混合标准放置时间、放置温度条件、介质溶剂均对外标法混标曲线测定有很大影响，但对内标法测定影响较小；这就有利于克服前处理过程时间过长造成的，目标化合物损失带来的测定误差；实验证实，单一目标化合物内标曲线的线性、斜率高于混标法，因为克服了目标化合物之间相互作用带来的误差；例如甲基内吸磷、内吸磷的单标曲线相关性、斜率高于相应单标曲线； 表三内标、回收率指示物和目标化合物内标法测定曲线 中文名称 色谱保留时间 定量离子 r a b 内标D8 5.180 136 甲胺磷 5.578 94 0.99703 -0.00304 0.04519 敌百虫 5.847 109 0.99842 0.000025 0.02040 敌敌畏 5.850 109 0.99988 0.001167 0.09406 速灭磷 8.992 127 0.99958 -0.00026 0.06854 乙酰甲胺磷 9.075 136 0.98509 -0.01145 0.02061 氧化乐果 12.433 110 0.99732 0.002233 0.01896 甲基内吸磷 13.133 88 0.99442 -0.01031 0.06914 久效磷 14.533 127 0.99363 -0.01305 0.04777 甲拌磷 14.700 75 0.99926 0.00422 0.08539 乐果 15.346 87 0.99774 0.002782 0.05826 内吸磷 15.450 88 0.99669 -0.00051 0.00402 己胺磷 16.592 138 0.99837 0.006333 0.02313 二嗪农 16.902 179 0.99465 0.005002 0.01384 乙拌磷 17.175 88 0.99680 -0.01183 0.11040 乙嘧硫磷 17.524 181 0.99852 0.000894 0.01091 稻瘟净 17.808 91 0.99625 -0.01556 0.09507 甲基对硫磷 18.864 109 0.99350 -0.00639 0.03358 马拉氧磷 18.988 127 0.99824 0.000083 0.01896 甲基嘧硫磷 19.999 290 0.99982 0.001267 0.01342 杀硫磷 20.000 125 0.99662 0.002750 0.02864 马拉硫磷 20.554 93 0.99966 0.013419 0.13092 倍硫磷 20.910 278 0.99901 0.008825 0.11029 对硫磷 21.074 97 0.99888 -0.00782 0.07919 水胺硫磷 21.263 136 0.99840 0.010845 0.06921 异硫磷 22.768 58 0.99792 0.075917 0.34926 奎硫磷 23.025 146 0.99877 0.007224 0.08968 稻丰散 23.608 274 0.99449 0.000961 0.04454 杀扑磷 23.844 85 0.99861 -0.00117 0.24404 克线磷 27.503 303 0.99436 -0.00350 0.01251 乙硫磷 28.560 231 0.99934 0.005304 0.07026 亚胺硫磷 29.858 160 0.99805 -0.00910 0.18481 内标D12 29.861 240 图一31种有机磷及内标在西红柿加标样品中的选择离子扫描总离子流图 表四稳定性实验(回收率指示物 D10 为代表) 第1天 第2天 第3天 第4天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天 d10/d8 0.042 0.500 0.476 0.512 0.435 0.470 0.496 0.387 0.469 d10/d12 0.248 1.723 2.233 2.279 2.217 2.067 2.329 2.362 2.090 第11天 第12天 第13天 第14天 第16天 第17天 第18天 第19天 第20天 d10/d8 0.000 0.495 0.517 0.507 0.570 0.687 0.561 0.462 0.016 d10/d12 0.001 2.310 2.171 2.150 2.252 2.394 2.297 2.250 0.113 第21天 第22天 第23天 第24天 第26天 第27天 STD d10/d8 0.670 0.517 0.546 0.687 0.507 0.561 14.84% d10/d12 2.395 2.252 2.310 2.394 2.016 2.297 7.05% 表五在不同样品中添加混合标准(样中浓度为 0.50mg/kg)的回收率 中文名称 色谱保留时间 定量离子 添加量 菜花 青菜 西红柿 内标D8 5.215 136 5 回收值 回收率 回收值 回收率 回收值 回收率 甲胺磷 5.635 94 2 1.084 54.22 1.637 81.84 1.452 72.61 敌敌畏 5.880 109 2 2.364 118.2 2.071 103.6 1.175 58.73 速灭磷 9.115 127 2 1.885 94.24 2.061 103.1 1.586 79.30 乙酰甲胺磷 9.165 136 2 1.699 84.94 3.099 154.9 2.243 112.13 甲基内吸磷 13.185 88 2 1.992 99.60 1.902 95.09 1.730 86.48 久效磷 14.595 127 2 1.601 80.04 1.375 68.73 2.063 103.16 甲拌磷 14.745 75 2 2.815 140.8 2.161 108.1 2.028 101.40 乐果 15.410 87 2 1.980 99.00 1.950 97.48 2.203 110.16 己胺磷 16.650 138 2 1.139 56.95 1.288 64.38 1.110 55.51 乙拌磷 17.230 88 2 1.401 70.04 1.857 92.84 1.735 86.74 乙嘧硫磷 17.575 181 2 1.670 85.00 1.930 96.5 1.524 76.20 稻瘟净 17.865 91 2 2.434 121.8 2.002 100.1 2.171 108.56 77.42 3.343 167.2 甲基对硫磷 18.920 109 2 1.548 马拉氧磷 19.050 127 2 1.525 76.23 2.117 105.9 2.026 101.29 甲基嘧硫磷 20.065 290 2 1.878 93.88 2.110 105.5 2.089 104.46 杀惧读蛄 20.060 125 2 1.904 95.22 2.124 106.2 2.312 马拉硫磷 20.615 93 2 1.739 86.94 1.526 76.31 1.266 63.29 倍硫磷 20.980 278 2 1.649 82.44 1.330 66.52 对硫磷 21.140 97 2 2.340 119.9 2.266 113.3 1.616 80.80 水胺硫磷 21.335 136 2 1.632 81.61 1.679 83.95 1.465 73.25 异硫磷 22.845 58 2 5.278 263.9 3.497 174.9 2.761 138.04 奎硫磷 23.110 146 2 1.587 79.33 1.593 79.66 1.283 64.16 稻丰散 23.095 274 2 1.499 74.96 1.529 76.43 0.969 48.46 杀扑磷 23.690 85 2 3.244 162.2 2.646 132.3 2.436 121.82 D10 23.930 212 5 4.879 97.58 4.357 87.14 3.638 72.75 克线磷 25.040 303 2 4.016 97.58 5.372 268.6 3.891 194.53 乙硫磷 27.545 231 2 1.798 89.91 2.075 103.8 1.450 72.48 亚胺硫磷 29.375 160 2 2.033 101.6 2.401 120.1 3.081 154.05 内标D12 29.415 240 5 5.3笔者进行了不同进样量、不同样品基质对内标、回收率指示物和31种有机磷目标化合物色谱保留时间的影响实验。结果显示，进样体积多于2.0od就会引起部分目标化合物峰形改变，从而引起色谱保留时间变化，所以最适进样体积为1~2o；在实际样品测定的浓度范围0~5.0mg/L内(上机前有机相浓度)，进样量引起的保留时间变化一般在 0.01-0.05min之间，敌百虫为0.1、马拉硫磷为0.19、稻丰散为0.06min；在不同样品基质菜花、青菜、西红柿影响下，当样品中添加浓度为0.5mg/kg时，样品基质引起的目标化合物保留时间变化一般在 0.01-0.05min之间，乙酰甲胺磷为0.08、马拉硫磷为0.07、乙硫磷为0.085、克线磷为 0.225min， 并且克线磷色谱保留时间随混合溶剂比例变化极大；本文所述方法充分考虑到了上述变化，在本文测定方法下，31种有机磷均没有测定歧视； 5.4笔者进行了以回收率指示物为代表的31种有机磷目标化合物测定结果稳定性试验，部分结果见表五。在连续一个月的测定中，尽管测定前处理过程、进样过程、仪器状态变化、试剂变化、环境温度变化等过程中存在各种无法克服的干扰和误差，回收率指示物氘代妣峰面积与内标气代屈、气代菲的峰面积比值平均相对偏差为14.84%和7.05%，结果是稳定的； 5.5笔者作了不同样品特别是蔬菜样品中加标实验，部分结果见表六，样品中添加浓度为0.5mg/kg时，菜花中回收率范围在54.5-140.8%之间，平均回收率为99.76%，其中回收率指示物回收率为97.58；青菜中回收率范围在 64.4-134.3%之间，平均回收率为108.9%，其中回收率指示物回收率为87.14%；西红柿中回收率范围在 64.4-190.5%之间，平均回收率为93.76%，其中回收率指示物回收率为72.70；完全符合农残测定要求； 5.6结论：本文研究的同时测定31种有机磷农药的 GC/MS 内标测定方法，不仅克服了气相色谱测定农药残留的缺点；也克服了GC/MS外标法在测定放处理过程、进样过程、仪器状态变化、试剂变化等过程中引进的各种无法克服的干扰和误差；将前处理中传统单一溶剂提取方法改为混合溶剂提取方法，经不同单位大量实际样品测定、及不同样品、不同浓度加标回收率实验证实，所有31种有机磷目标化合物在该测定方法下，不存在测定歧视，结果准确度、重现性良好，灵敏度达到国家标准要求，完全可以取代气相色谱法，在定性、定量准确性方面优于气相色谱法。 ( 参考文献： ) ( 1.《中华人民共和国国家标准》，GB/T 47 8 9.33-4789.35-2003；P151-157； ) ( 2.《中华人民共和国国家标准》， GB/T 5 0 09.101-5009.203-2003；P7-31，P39；P59等 ) ( 3.张敏恒，农药商品手册，沈阳出版社，1999.8； ) ( 4.杜英娟.国外杀菌剂的发展近展，农药，1989，28(1)：48. ) ( 5.美国EPA方法525.2，固相萃取-毛细管气相色谱质谱测定饮用水中的有机化合物 ) ——