油炸方便面中丙烯酰胺含量检测方案(气质联用仪)

气相色谱质谱联用测定油炸方便面中丙烯酰胺含量的方法研究 李永香1， 曹书霞2，，钟南京 (1.郑州市疾控中心，郑州450053： 2.郑州大学化学系，郑州450052.3.河南工业大学，郑州450052) 摘要：建立油炸方便面中丙烯酰胺的气相色谱-质谱联用(GC/MS)内标分析方法。采用柱前溴化衍生的方法，以甲基丙烯酰胺为内标，分别就方便面中丙烯酰胺的提取、富集、净化、分离、检测等过程中的分析检测影响因素进行了实验研究，并采用GC/ECD、GC/FTD、GC/MS分析测定对比，在37.5 u g /kg 加标水平样品回收率范围61.0~96.0%，平行测定7次相对标准偏差9.8%，标准系列在实际样品含量范围0~5.00mg/L范围内线性良好。选择离子检测方式定量检测下限为： (S/N=10) 33.2og/kg，选择离子检测方式定性检测下限为：(S/N=3)9.98 u g/kg。该方法定性、定量准确度均优于气相色谱法，适合于常规油炸方便面中丙烯酰胺的测定。 关键词：气相色谱-质谱联用，丙烯酰胺，油炸方便面 丙烯酰胺是一种水溶性的神经毒性物质，国际癌症研究机构已将其列为对人类很可能的2A类致癌物质。瑞典国家食品管理局于2002年首次从某些油炸或焙烤食品中检出了高含量的丙烯酰胺，该研究结果引起了各个国家及研究机构的广泛关注1~3]。随后的研究也进一步证明了油炸食品中含有较高含量的丙烯酰胺，并且过度油炸会进一步增加食品中丙烯酰胺的含量。丙烯酰胺在食物中的微量分析，当前仍没有取得在全球范围内既准确灵敏经济可操作执行，又有良好再现性的统一方法，但色质联用是最具发展前景的分析方法已成共识。目前在国际示对于食品中丙烯酰胺含量的分析方法有气相色谱-质谱联用法[4.5]以及液相色谱-质谱联用方法[6，7，但在国内这方面的研究还较少[8~10]。食物中丙烯酰胺的分析取决于食物基体对测试的影响，同种食品检测数据大的变幅以及基体效应等对最终检测结果均有干扰。本文采用柱前溴化衍生的方法，以甲基丙烯酰胺为内标，利用GC/MS建立了油炸方便面中丙烯酰胺的分析方法。详细讨论了方便面中丙烯酰胺分析检测时的各种影响因素，主要对方便面中待测组分的提取、富集、净化、分离、检测等过程进行了详尽的实验探讨，并对丙烯酰胺溴化衍生物质谱响应信号与甲基丙烯酰胺溴化衍生物相比较低的原因进行了探讨。本实验所建立的方法定性、定量准确度均优于气相色谱法和气相色谱-质谱联用外标法，适合于常规油炸方便面中丙烯酰胺的测定。 1、材料与方法 1.1仪器与试剂 岛津 GCMS-QP2010气相色谱质谱仪，EI源；粉碎机；超声波提取器；电动振荡器；旋转蒸发仪；GL-16高速台式离心机(16000r/min 以上)；旋涡式振荡器。 溴化钾(200g/L水溶液)、饱和溴水、石油醚、无水硫酸钠(经300℃干燥)、亚硫酸钠(100g/L水溶液)、氯化钠、乙酸乙酯(重蒸)、正己烷均为分析纯；水为去离子水；标子储备液：1.00mg/mL甲基丙烯酰胺和1.00mg/mL丙烯酰胺的水溶液；标准使用溶液的配制：准确移取上述标准储备液，临用时用纯水稀释成 10.0og/mL； 1.0mol/L硫酸溶液；溴制剂：加入过量的溴到pH为1.0(用硫酸溶液调节) 的溴化钾水溶液中，取上层液使用，保存于冰箱内；混合有机溶剂(乙酸乙酯与正己烷体积比=4：1)。 1.2供试样品 河南工业大学食品工程学院研究生采用不同实验工艺流程、在不同生产条件(主要是改变油炸温度和时间)下自制的方便面样品。 1.3色谱质谱条件 色谱柱采用 DB17-MS柱(30m×0.25mm × 0.25om)；载气为氦气；进样口温度为230℃；进样方式为不分流进样，分流测定；进样量1oL；柱流量采用1.00ml/min，压力控制模式；分流测定分流比：10。柱升温程序为100℃保持1.0 min， 再以30℃/min升到180℃，然后以10℃/min 升到200℃，接着以40℃/min升到220℃保持 5min。 离子源温度：200℃；接口温度：250℃；电子轰击能：70eV；溶剂切除时间：5.0min；检测方式：SCAN，扫描时间段5.50-7min，扫描质量范围：40-400，扫描间隔： 0.5sec； SIM， 扫描时间段5.5-6.5min，选择离子44、106、108、150、152、41、120、122、164、166。 1.4实验方法 1.4.1样品及标准系列前处理： 样品前处理(处理方法1)：取粉碎混匀样20.00g，加入10og甲基丙烯酰胺，100ml水，1ml硫酸溶液，混匀，40℃超声提取 1h；4000转/分离心5min，过滤上清液，收集水相，在水相中加过量溴制剂(15ocL以上)4℃避光衍生过夜；在水相中加亚硫酸钠滴定过量溴，以 50ml混合溶剂分3次是取，合并有机相，无水硫酸钠脱水，50℃旋转蒸发浓缩，混合有机溶剂定容至2ml，取上清液1ml以12000转/分离心2min ， lod进样。 标准系列前处理(处理方法2)：分别移取丙烯酰胺标准(10.0cg/ml)0、0.075、0.125、0.250、0.500、1.00ml至预先加有100ml纯水的具塞锥形瓶中，各加入甲基丙烯酰胺内标10og， 1ml硫酸溶液，混匀，加15mL溴制剂4℃衍生过夜(12h)，其他步骤同处理方法1。 1.4.2气相色谱--质谱仪定性定量方法： 全扫描检测模式定性标准：采用全扫描谱库检索与相应保留时间提取质量色谱图进行特征选择离子定性相结合的方法定性； 选择离子检测模式定性标准：相应保留时间下，各化合物中，至少1对同位素峰丰度比符合要求，至少三个特征鉴定离子的丰度比不大于标准的相同离子丰度比的±20%。 定量计算：分别以150作为丙烯酰胺定量离子、122作为甲基丙烯酰胺定量离子，峰面积比扣除空白后与标准比较定量。可采用内标标准曲线法定量，也可采用单标进行内标法定量。 图1为20.00g方便面样品基质中，丙烯酰胺及内标添加量为 250cg/kg时，经GC/MS测定的色谱图、质谱图及鉴定离子丰度比： 图1. GC/MS测定的总离子流图(a)以及5.34、5.50min对应的质谱图(b、c) 2、结果与分析 2.1进样口温度选择试验 实验结果表明，进样口温度大于230℃，信号下降明显，可能由因丙烯酰胺溴化衍生物热分解所致；进样口温度小于200℃，色谱信号同样下降，可能由因丙烯酰胺溴化衍生物汽化不完全所致，本研究方法选择进样口温度230℃。 2.2溴制剂用量对测定结果的影响试验： 2.2..11分别做10 ug标准样品和内标物的衍生化试验，实验过程同处理方法2，加溴制剂15ml后溶液呈现溴水颜色，经多次测定，两者特征定量离子峰面积分别为A150=8500±200； A120=233704±1000，定量离子峰面积之比为 0.036±0.005，溴制剂用量加大，多次测定结果变化不大。 2.2.2分别做油炸方便面样品的加标回收试验，取平行样品，分别加入10 ug标准样品和内标物溶液，其中试验1平行样加加制剂15ml 后溶液不呈现溴水颜色，经提取、过滤、衍生、萃取、净化后，经质谱测定，检不出丙烯酰胺溴化衍生物，甲基丙烯酰胺溴化衍溴物特征定量离子峰面积A120=50754±150；其试验2平行样加溴制剂15ml后溶液不呈现溴水颜色，继续添加溴制剂至溶液呈现溴水颜色并多加1ml，经相同的提取、过滤、衍生、萃取、净化后，经质谱测定，丙烯酰胺溴化衍生物 A150=9937 ±100，甲基丙烯酰胺溴化衍生物特征定量离子峰面积A120=338131±200，定量离子峰面积之比平均值为0.028。说明样品中不饱和脂肪酸等消耗了溴制剂，可能使得标准和内标的衍生化反应不充分，此类样品测定时加大溴制剂用量可以提高衍生化效率。 2.2.3在溴制剂过量基础上，不断加大溴制剂在衍生化试验水溶液中的浓度进行试验，结果表明，其他试验条件相同情况下，溴制剂在衍生化试验水溶液中浓度的增加对结果影响不明显。 2.2.4综合上述试验结果，在进行样品测定时，溴制剂加入量应视样品特性适当调整，以添加溴制剂至溶液呈现溴水颜色并多加1ml为宜。 2.3超声提取温度对结果的影响试验 分别做油炸方便面样品的加标回收试验，取平行样品三份，分别加入10cg标准和内标，混匀，分 别经常温、40℃和80℃超声提取1h，其余步骤同处理方法1。检测结果显示，常温超声提取样检不出标准，只检出内标；40℃和80℃超声提取样均检出标准和内标，因丙烯酰胺受热不稳定，故选择超声提取温度为40℃比较合适。 2.4旋转蒸发温度对结果的影响试验 100ml水中加入10g标准和内标，取平行样品进行测定，试验1样三份，旋转蒸发温度80℃；试验2样三份，旋转蒸发温度50℃；试验3样三份，无旋转蒸发过程，仅靠N2吹浓缩，而其他操作步骤均同处理方法2。检测结果显示，试验2平行样信号强度大于试验1、3平行样，且浓缩时间和成本远低于试验3平行样，因此选择旋转蒸发温度为50℃较为合适。 2.5萃取用有机溶剂对萃取效率的影响试验 试验1，100ml水中加入10g标准和内标，萃取溶剂为重蒸乙酸乙酯，其他操作步骤同处理方法2；试验2，萃取溶剂为混合溶剂重蒸乙酸乙酯：正己烷(V/V)=(4：1)，其他操作步骤同试验1。检测结果，试验1样定量离子峰面积之比= A150/A120=7297/233704=0.031；试验2样定量离子峰面积之比=A150/ A120=8500/273704=0.031。进行多组平行样品测定，结果试验2样绝对信号强度均大于试验1平行样，证实混合溶剂萃取效率略高于单一溶剂乙酸乙酯，因此本研究选择萃取用溶剂为混合溶剂乙酸乙酯：正己烷(V/V)=(4：1)。 2.6净化过程对结果的影响试验 分别做油炸方便面样品的加标回收试验，取平行样品四份，其中平行样1，加入10cg内标，混匀，以20ml乙醚洗去样品所含油分，滤除乙醚，样品常温挥干乙醚后，加入100ml水提取，其余步骤同处理方法1；其中平行样2，加入10cg内标，混匀，不用乙醚除油，步骤同处理方法1；其中平行样3，分别加入10cg标准和内标，混匀，加入100ml水提取、衍生，在混合溶剂萃取后，有机相过硅藻土柱净化，洗脱，其余步骤同处理方法1；其中平行样4，在混合溶剂萃取后，有机相过无水硫酸钠柱脱水，其余步骤同平行样3。检测结果，样1定量离子峰面积=A120=16517，样2定量离子峰面积=A120=62635；样3检不出标准和内标；样4，定量离子峰面积比=A150/A120=7695/180744=0.0426。实验证实， 乙醚除油过程降低了样品加标回收率，采用硅藻土柱净化，难以洗脱标准和内标衍生物，因此测定前处理中不能采用乙醚除油、和硅藻土柱净化等净化过程。 2.7丙烯酰胺溴化衍生物质谱响应信号与甲基丙烯酰胺溴化衍生物相比较低，该现象原因探讨试验： 2.7.1检测器选择性影响因素试验： 2.7.1.1GC-FTD检测器实验：试验1平行样，10cg丙烯酰胺单标准试验，试验过程同处理方法2，A=76758±350；试验2平行样，10cg甲基丙烯酰胺单标准试验，试验过程同处理方法2， A=5291±350；试验3平行样，10cg丙烯酰胺、10cg甲基丙烯酰胺混合标准试验，试验过程同处理方法2，A/A内标=82979±350/80793±350=1.03±0.02；丙烯酰胺与甲基丙烯酰胺溴化衍生物响应灵敏度无显著性差异。 2.7.1.2 GC-ECD检测器实验：试验1平行样，1.0cg丙烯酰胺单标准试验，试验过程同处理方法2，A=7435448 ±3000；试验2平行样，1.0cg甲基丙烯酰胺单标准试验，试验过程同处理方法2，A=4354619±3000；试验3平行样， 1.0og丙烯酰胺、1.0cg甲基丙烯酰胺混合标准试验，试验过程同处理方法2，A/ A内标=8592250±3000/3675010±3000=2.34±0.01；丙烯酰胺溴化衍生物响应灵敏度高于甲基丙烯酰胺溴化衍生物。 2.7.2综合分析实验结果，丙烯酰胺溴化衍生物质谱响应信号与内标相比较低，是此两种化合物质谱响应灵敏度不同所致，与前处理过程无关。 2.8在以上优化实验条件的基础上，标准系列测定试验及精度测定试验结果 在37.5og/kg加标水平样品回收率范围61~96%，对0.50mg/L标准平行测定7次相对标准偏差9.8%，标准系列在0~5.00mg/L范围内线性良好，相关系数为0.9991，标准系列特征离子峰面积比分别为(A150/A120)：0.0110、0.0186、0.0295、0.0534、0.0998，标准曲线y(A150/A120)=0.0189*x(标准mg/L)+0.0056；采用本底值为 13.5og/kg (GC-FTD定量， GC-MS确证)的样品进行7个平行样品加标回收试验，分别加入0.75og标准(相当样品中浓度37.5og/kg)，测定结果分别为：0.77、0.89、0.79、0.89、0.73、0.99、0.85og，对应回收率分别为：66%、83%、69%、83%、61%、96%、777% 2.9完全按方法操作，全扫描方式定量检测下限为 (S/N=10) 250og/kg，定性检测下限为：(S/N=3)75og/kg；选择离子检测方式定量检测下限为：(S/N=10) 33.2og/kg， 选择离子检测方式定性检测下限为： (S/N=3)9.98 u g/kg。实际操作中，为降低检测限，可采用加大样品量、浓缩有机相等方式进行测定。检测50份不同生产工艺下自制的方便面样品，16%样品测定结果小于检测限，82%样品检测结果在16.2-89.5cg/kg之间，一份样品检测结果为132.2cg/kg。综合分析实验结果和生产工艺，方便面中丙烯酰胺的含量与油炸温度、加热时间、原料品质、样品改良剂等许多因素均有相关关系。 ( 参考文献： ) ( [1]Tareke E， Rydberg P， Karlsson P， et al. 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