莲须中槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙检测方案(毛细管电泳仪)

分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry第8期1187~1190第35卷2007年8月 分析化学第35卷1188 毛细管电泳紫外检测法测定 莲须中的沛皮素、木犀草素、山萘酚、异皮甙 荆瑞俊*1，2 姜小莹1.2 侯书荣"2 李向军 袁倬斌 (河南科技学院化学化工学院，新乡 453003) (中国科学院研究生院化学与化学工程学院，北京了100049) 摘 要 采用毛细管区带电泳紫外检测法(CZE-UV)同时测定中药莲须中槲皮素、木犀草素、山萘酚、异槲皮甙4种有效成分。研究了缓冲溶液的离子浓度、pH值和电压对分离度和迁移时间的影响，得到了最佳分离实验条件。在离子浓度为 40 mmol/L NaB40，缓冲溶液(pH9.0)中，分离电压为16 kV，波长为254nm时，檞皮素、木犀草素、山萘酚、异皮甙4种物质在10min内得到了良好的分离测定，其检出其分别为5.0、6.7、4.5和 6.0mg/L。本方法应用于实际样品的测定，结果令人满意。 关键词莲须，檞皮素，木犀草素，山萘酚，异槲皮甙，毛细管电泳 1 言 高效毛细管电泳以高压直流电场为驱动力，以毛细管作分离通道，依据样品之间电离度和分配行为上的差异而实现分离，具有高效、快速、样品用量少等优点，与传统的高效液相色谱分析法相比，它进样体积小(1~50uL)1，21用时短，而且不会污染柱。在中药有效成分分析中已得到了广泛应用。 莲须为睡莲科植物莲的干燥雄蕊，用于治疗遗精滑精、带下和尿频。莲须、荷叶、莲子心和莲子均为莲的不同药用部位。化学成分和含量测定方法集中在莲子上，对莲须中的有效成分分析还不多见，孟孟生等使用高效液相色谱分析了莲须中的檞皮素和山萘酚。王月伶等“采用离子液体修饰毛细管胶束电动色谱法测定了皮素和异檞皮甙。本实验采用毛细管电泳紫外检测同时分离测定了莲须中的檞皮素、木犀草素、异皮甙和山萘酚。在优化的实验条件下，上述4种组分能被完全分离测定。本实验方法简便、快速，为莲须的质量分析提供了新的指标性成分的分析方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司、中科院研究生院应化所)，检测波长范围为190~700 nm；未涂层弹性石英毛细管柱(50um id，总长50 cm，有效长度40 cm，(河北永年光导纤维厂)，pHS-3B酸度计(上海雷磁仪器厂)，H6605型超声清洗机(无锡电子设备厂)。 标准对照品：横皮素、木犀草素、异皮甙、山蒂酚(Sigma公司)、莲须(北京同仁堂药店)，其它试剂均为分析纯。实验用水为三次蒸馏留。 1.0g/L标准溶液的制备：准确称取檞皮素、木犀草素、异皮甙和山萘酚对照品，分别用乙醇溶解，以0.45um酸纤维滤膜过滤后备用。 2.2 实验方法 以 40 mmol/L Na B40 (NaOH调节至pH9.0)缓冲溶液为电泳介质。未涂层弹性石英毛细管(50 um i d，总长 50 cm，有效长度为40 cm)。所有溶液使用前均用0.45 um滤膜过滤。毛细管使用前用 0.1 mol/L NaOH、水、电泳缓冲溶液各冲洗10min，然后在每次电泳后分别用0.1mol/L NaOH、水、缓冲溶液冲洗5、5和2m in，可保持迁移时间和峰高良好的重现性，然后进行分离测定，采用重力进样，进样高度10cm，进样时间6 s，分离电压16kV，检测波长254mm。所有实验均在室温下进行。 ( 2006-09-20收稿；2007-03-07接受 ) ( 本文系国家自然科学基金 (No. 20175025，29875027)、国家自然科学基金分析化学重点基金 (No.20235010)资助项目 ) ( * E mail： jrjhn1025@hist e du c n ) 2.3 样品溶液的制备 莲须样品粉碎，过筛(20um)后，准确称取4.6101 g，加人50mL乙醇，水浴加热回流4h，趁热过滤，滤液蒸发至15mL，然后再稀释定容至 50mL，样品溶液以 0.45 um滤膜过滤后备用。 3 结果与讨论 3.1 缓冲溶液 pH及其浓度的影响 本方法分别以 NaB4O溶液、NaHPO NaH，PO混合溶液和 Na HPO4 NaB4O混合溶液、NaH，PO4-NaB40，混合溶液为缓冲溶液进行电泳分析实验，结果发现，以NaB40溶液作为电泳缓冲溶液分离效果最好。缓冲溶液的 pH值是影响组分分离的主要因素，它可以影响 Zeta电势(势)、电电流(FOF)和分析物的带电情况，进而影响分析物的迁移时间~。在实验过程中得知，随着 pH值的增大，迁移时间延长，但增大程度不同， 上述4种物质具有不同的迁移时间和出峰顺序，如图1所示。pH对4种分析物迁移时间的影响如图2a所示。其迁移时间随 pH的增大而延长。4种物质的出峰顺序也有变化。随 pH值的增大4种物质之间的分离度增大，而电流也随着增大，本实验选择缓冲溶液为 pH 9.0. 图2b是缓冲溶液浓度对分析物迁移时间的影响，随着缓冲溶液浓度的增加，4种分析物的迁移时间延长，分离度提高。考虑到增加缓冲溶液浓度会增加焦耳热效应，造成基线噪音增加，影响分离度，本实验选择40 mmol/LNaB八O，缓冲溶液。 图1 pH值对4种物质迁移时间和出峰顺序的电泳图 Fig 1 Effect of buffer pH on the migration time and order ofapex 3. 2 工作电压的影响 1. 异檞皮甙 (isoquercitrin)；2.山酚(kaempferl)；3.木犀草素(luteolin)；4.檞皮素(quercetin)。 图3是工作电压对迁移时间的影响。实 验中得出各组分的迁移率随分离电压的降低而减小，迁移时间延延，分离度提高，但谱带展宽且峰高降低。随着电压的升高，电流升高，基线噪声增加，使分离度降低。综合考虑分离度、焦耳热效应和分离时间等因素，本实验选择工作电压为16kV。 图2缓冲溶液的酸度(a)和缓冲溶液浓度(b)对迁移时间的影响 Fig 2 Effect of buffer acidity (a) and buffer concentration (b) on m igration time of the analytes1.异檞皮甙(isoquercitrin)；2.山萘酚(kaempferol)；3.木犀草素(luteolin)；4.檞皮素(quercetin)。 3.3 标准曲线、重现性及检出限 在上述优化实验条件下，4种物质在10min内能够良好分离，标准混合物的分离电泳图谱如图4所示。对一系列异皮甙、山萘酚、木犀草素、斛皮素的标准混合样品进行分析测定，测定其峰面积与浓度 的关系，所得异槲皮甙、山萘酚、木犀草素皮素的线性范围、线性方程、相关系数及检出限(S/N=3)如表1所示。 图3 电压对迁移时间的影响 Fig 3 Effect of voltage on the migration time of the ana-lytes 1.异皮甙(isoquercitrin)；2.山萘酚(kaempferol)；3.木犀草 素 (luteolin)；4.檞皮素(quercetin)。 图4 标准溶液(a)与样品溶液(b)的毛细管电泳图谱 Fig 4 Cap illary electropherograms of standard mixture(a) and sample sulution (b) 1.异檞皮甙(isoquercitrin)；2.山萘酚(kaempferol)；3.木犀草素(luteolin)；4.皮素(quercetin)。 表1 异纬皮甙、山萘酚、木犀草素、斛皮素的线性范围、线性方程、相关系数 Table 1 linear concentration， linear equation， relative coefficient and detection limit of isoquercitrin， kaempferol， luteolin andquercetin 组分 线性范围 线性方程 相关系数 检出限 Component Linear range (mg/L) Linear equation Correlation coefficient (r) Detection lim its (mg/L) 异皮甙 Isoquercitrin 20~1000 Y=41558X+999.85 0.9982 0.0050 山山酚 Kaempferol 18~1000 Y=53346X+671. 54 0.9991 0.0067 木犀草素 Luteolin 200~1000 Y=107964X-254. 50 0.9992 0.0045 檞皮素 Quercetin 20~1000 Y=72715X+919.56 0.9974 0.0060 通过连续进样含有4种物质的0.200 g/L的标准溶液，连续进样6次，计算重现性，测得4种物质的峰高和迁移时间的RSD分别为：异皮甙峰高为1.5%迁移时间为1.8%；山萘酚峰高为3.5%迁移时间为1.4%；木犀草素峰高为1.3%、迁移时间为1.9%；皮素峰高为2.9%迁移时间为1.9%。 3.4：样品测定 利用所建立的方法分析了莲须样品中的异檞皮素、山萘酚、木犀草素和檞皮素，样品电泳图谱如图5所示，4种组分的含量分别为0.279、0.368、0.362和0.240 g/L。根据标准加入法进行定性，向样品中准确加入一定量的异檞皮甙、山萘酚、木犀草素、槲皮素，做加入回收实验。样品的加入回收实验结果如表2所示。 表2加入回收实验结果(n=6，g/L) Table 2 Result of recovery of standard addition(n=6，g/L) 化合物 原有值 加入值 加入后测得值 回收率 Component Original(g/L) Added(g/L) Found(g/L) Recovery(%) 0.1000 0.3388 99.4~102 皮素 Quercetin 0.2404 0.3000 0.5390 99.6~101 0.6000 0.8385 99.7~105 0.1000 0.4588 99.3~100 木犀草素 Luteolin 0.3622 0.4000 0.7700 98.8~103 0.6000 0.9485 98.6~101 0.1000 0.4535 96.8~99. 7 山山酚 Kaempferol 0.3683 0.4000 0.7578 97.0~102 0.6000 0.9638 99.5~106 0.1000 0.3654 96. 5~99.0 异子皮甙 Isoquercitrin 0.2788 0.3000 0.5813 97.6~101 0.6000 0.8756 99.6~104 ( References ) ( Chen Yi(陈 义). T echnique and Application of Capillary Electrophoresis (毛细管电泳技术与应用)(第一版). Beijing(北 京). C hem ical Industry Press(化学工业出版社)，2000：5~6 ) ( 2 Cao RuiM in(曹瑞敏)，Su Wei(苏 玮)， Su Qing (苏 庆). Joumal of Traditional Chinese M edicine (中华中医杂志)， 2005，20(4)：237~239 ) ( Meng Xian-Sheng(孟宪生)， Sh a M ing (沙 明)， Cao AiM in (曹爱民)， Jiang Li(姜 丽) ， Deng Tie-Hong(邓铁宏).Chinese Traditional PatentM edicine(中成药)，2003，25(12)：1004~1006 ) ( 4 Wang YueLing(王月伶)， Hu ZhongBo (胡中波)， Yuan ZhuoBin(袁倬斌). a Chinese J J Anal Chem.(分析化学)， 2006，34(12)： 1 741~1744 ) ( L iiYuanQi(吕元琦)， Wang Yue-L ing (王月伶)， Yuan Zhuo B in(袁倬斌). . P hysical T esting and Chen icalAnalysis： Part B： Chem ical Analysis， (理化检验―化学分册)，2005，41(7) ： 64~66 ) ( 6 L iiYuanQi(吕元琦)，Wu Chun-Hua(邬春华)， Yuan Zhuo-Bin (袁倬斌). . J J oumal of Instrum en tal Ana lysts(分析测试学报)，2004，23(4)：98~100 ) ( 7 Wang YueLing(王月伶)，L ii YuanQi(吕元琦)， Yuan Zhuo B in (袁倬斌). Chinese Joumal of Ana lysis L abora tory (分析试验室)，2005， 24(Sup)： 1 10~111 ) Determ ination of Quercetin， Luteolin， Kaempferol andIsoquerc itrin n Stam en Nelum bin is by Cap illaryZone Electrophoresis-Ultrav iolet D etection Jing Rui-Jun*12， Jiang Xiao-Ying， Hou ShuRong， Li Xiang-Jun’， Yuan Zhuo Bin (Chen ical Engineering， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003) (College of Chen istry and Chen ical Engineering， Graduate University of the Chinese Acadeny of Sciences， Beijing 100049) Abstract The detem ination of quercetin， luteo lin， kaemp ferol and isoquercitrin in the Chinese herbal-stamennelumbinis by cap illary zone electrophoresis (CZE) with ultraviolet detection (UV) is reported The analyticalconditions were op tim ized through investigation of the effects of buffer pH， buffer concentration and appliedvoltage The op tim ized conditions are as following： 40 mmol/L NaB4O， solution (pH=9.0)， working voltage of 16 kV and detection wavelength of 254 nm， the detection lim its were 5. 0， 6. 7， 4. 5 and 6. 0 mg/L，re spectivelyThese four analytes can be well-separated in 10 m in Keywords Stamen nelumbinis， quercetin， luteolin， kaempferol， isoquercitrin cap illary electrophore sis ( (Received 2 0 S ep tember 2006； accep ted 7 March 2007) ) <电分析化学与生物传感技术》 电分析化学利用物质的电学和电化学性质进行表征与测量。它不仅能进行组成和形态分析，而且对电极过程的理论研究和生命科学、信息科学、环境科学的发展具有重要的作用。该书从电分析化学研究涉及的电化学基础知识出发，总结了现代电分析化学研究常用方法的基本原理，概括和吸收了国内外近年来在电分析化学与生物传感器领域的新成就和相关文献，阐述了当代电分析化学及其在生命分析化学特别是生物电化学研究中的应用，对电分析化学与生物传感器新技术的原理和方法作了深入浅出的论述，并对各领域的应用作了详细的介绍。该该书作者南京大学鞠 先教授，由科学出版社出版。《电分析化学与生物传感技术》分析化学新方法、新技术丛书之一。 C China Academic Journal Electronic Publishing House. 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