农药三唑酮中分子印迹聚合物检测方案(毛细管电泳仪)

河北大学学报(自然科学版)Journal of Hebei University (Natural Science Edition)Vol.26 No.4Jul.2006第26卷 第4期2006年 7月 第4期吴文镶等：农药三唑酮分子印迹聚合物的识别特性研究·397 农药三唑酮分子印迹聚合物的识别特性研究 吴文镶，李 莉²，杨更亮34，李志伟，张国庆 (1.廊坊师范学院继续教育中心，河北廊坊 065000；2.河北理工大学轻工学院，河北唐山 063020： (3.中国科学院化学研究所分子科学研究中心，北京 100080；4.河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002) 摘 要：采用分子印迹技术合成了对农药三唑酮有高选择性的印迹聚合物，通过 Scatchard 分析研究了印迹聚合物的结构特性.结果表明，以甲基丙烯酸为功能单体的印迹聚合物，通过氢键作用可以形成两类结合位点.用多点结合模型计算两类结合位点的离解常数分别为K1=7.89 ×104mol/L，K2=3.53×10mol/L.底物的选择性结合实验表明，该聚合物对三唑酮呈现高度的选择性及识别能力.为在生物样品中选择富集三唑酮提供了可能性. 关键词：分子印迹技术；印迹聚合物；三唑酮；底物选择性 中图分类号：O652.6 文献标识码：A 文章编号：1000-1565(2006)04-0396-05 Characteristics of Molecular Recognition of Triadimefon Imprinting Polymer Wu Wen xiang’，LIli?， YANG Geng-liang 4，LI Zhi-wei，ZHANG Guo-qing (1. Center of Continued Education， Langfang Teachers College ，Langfang 065000 ，China； 2. Light Industry Branch， Hebei Polytechnic University，Tangshan 063020 ，China； 3. Center for Molecular Science， Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080，China；4. College of Chemistry and Environmental Science， Hebei University， Baoding 071002 ，China) Abstract ：A molecular imprinting polymer with high selectivity for triadimefon was prepared by a molecularimprinting technique. The selective binding characteristics of the imprinting polymer was evaluated by Scatchardanalysis. The multiple-sites binding model was used to calculate the maximum number of binding sites and thedissociation constant. The results showed that the imprinting polymer using methacrylic acid(MAA) as func-tional monomer could form two kinds of binding sites. The dissociation constants were estimated to be Ki=7.89 x10-4mol/L and Kz=3.53 ×10=3mol/L. The selective binding experiment for substrates indicated thatthe polymer gave much higher affinity and selectivity for triadimefon than for triadimenol and imidacloprid. It's possible to be a good way in selective enrichment and determination of trace Triadimefon in complex samples.Key words： molecular imprinting technique； imprinting polymer； triadimefon； substrate selectivity ( 分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(印迹分子)完全匹配的聚合物的实验制 ) ( 收稿日期：2005- 0 6-25 ) ( 基金项目：廊坊师范学院自然科学资助项目(LSZYZ200401) ) ( 作者简介：吴文镶(1964-)，女，河北文安人，廊坊师范学院副教授，从事有机化学教学工作. ) 备技术11.它是通过以下方法实现的：1)印迹分子与具有适当功能基的功能单体通过氢健作用、离子作用或疏水作用在一定条件下形成主客体复合物；2)通过光引发或热引发在大量交联剂存在下进行自由基聚合反应，将主客体络合物固定在高度交联的高分子母体中，制得高聚物；3)通过一定的方法洗去印迹分子得到在高分子共聚物中留下与印迹分子在空间结构上完全匹配，并含有与印迹分子专一结合的功能基的三维空穴.分子印迹聚合物[2]中有类似于酶和抗体的结合点，该技术已成功地用于氨基酸及其衍生物[3-4]41，糖及其衍生物5]的特定性识别和药物16-71的手性分离及识别181.三唑酮是一种广泛使用的广谱杀虫农药，广泛应用于防治蔬菜、果树、小麦等的白粉病和锈病，但使用中也存在农药残留问题，因此，控制并检测其在食品中的含量，推算最佳的给药量对达到最好防治的效果具有实际意义.本文以三唑酮为印迹分子，以甲基丙稀酸为功能单体，制备了对三唑酮有高选择性的印迹聚合物，研究了此聚合物对三唑酮及与其结构相似的底物的识别能力.结果表明，与化学组成相同的相应非印迹聚合物相比，三唑酮分子印迹聚合物对三唑酮有较大的吸附性能和高度的选择性. 实验部分 1.1 仪器与试剂 三唑酮、三唑醇和吡虫啉(石家庄三农有限公司提供)；偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，购自上海天莲精细化工有限公司，使用前重结晶提纯)；a-甲基丙烯酸(MAA，分析纯，北京东环联合化工厂)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，为ACROS公司(北京百灵威公司进口)产品)；乙腈、甲醇购自天津康科德公司为色谱纯；醋酸购自天津化学试剂三厂；三次蒸馏水.其余试剂均为分析纯. ACS2000高效毛细管电泳液相色谱一体机，紫外可调检测器(DETECTOR K-2501)；AeS-2000 色谱工作站；超声波发生器(CSF-1A 上海超声走仪器厂)；恒温水浴箱(Gallen Kamp 英国). 1.2 聚合物的合成 1.2.1 甲基丙烯酸为功能单体的印迹聚合物P(Tria)的合成 称取印迹分子三唑酮0.2935g于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿15mL使之溶解，再加入MAA0.52 mL ，于超声波中超声1h，以使三唑酮与MAA充分作用.然后再加入EDMA 5.7 mL 和0.0646gAIBN，超声0.5h，充分混溶后，通N2脱氧 15 min ，真空状态下密封，将其放入55℃的恒温水浴中反应24h后取出，制得块状聚合物.将获得的块状聚合物研碎，过65 pm筛后得到的颗粒用三次蒸馏漂洗，倾析法除去悬浮的微细粒子，然后用10%醋酸水溶液洗至无印迹分子，最后用三次蒸馏水洗涤除去残留的乙酸，将颗粒放入真空干燥箱中烘干即得所用的印迹聚合物(P(Tria)). 1.2.2 甲基丙烯酸为功能单体的非印迹聚合物(P(B))的合成 除不加印迹分子三唑酮外，其余与上述制备方法相同，得空白印迹聚合物(P(B)). 1.3 实验方法 1.3.1 平衡结合量的测定 将洗涤好的粒状聚合物30.0 mg 放入10mL磨口锥形瓶中，加入3.0mL 不同浓度的三唑酮乙腈溶液，放入恒温水浴振荡器中，室温下振荡24h，然后过滤，用HPLC方法测定吸附液中三唑酮的浓度.所用色谱柱为C18柱(4.6 mm X150 mm)；以甲醇为流动相，流速1 mL/min，进样量 10uL，检测波长234 nm.根据吸附前后溶液中三唑酮浓度的变化计算聚合物对底物的吸附量，平衡测定3次，取平均值.吸附底物后的印迹聚合物按照除去印迹分子的方法洗去底物，干燥后可重复使用. 2 结果与讨论 2.1 印迹分子与功能单体的作用方式 Nittsson 等用色谱法证明了脂肪胺与羧酸间可以产生离子作用19，芳香胺的碱性较弱与羧酸间可以产 生氢键作用.由此可推测印迹分子与功能单体MAA的作用形式，如图1所示. 图1 三唑酮分子印迹聚合物制备 Fig.1 Preparation of tria dimefon- imprinted polymer( P(Tria )) 2.2 印迹聚合物与三唑酮的结合能力 为研究印迹聚合物的结合特性，用平衡吸附实验测定了三唑酮分子印迹聚合物及P(B)的结合量0对不同浓度三唑酮吸附液的吸附等温线(见图2). 图2 P( Tria)及 P(B)对三唑酮的吸附等温曲线 ■-P(Tria)；●-P(B) Fig. 2 Adsorption isotherms of P(Tria) and P(B) to triadimefon 图3 评价 P(Tria)结合性质的 Scatehard图 Fig.3 Scatchard plots to estimate the binding nature of P(Tria) 结果显示，与P(B)相比，P(Tria)对三唑酮具有很高的亲和力.在所测定的浓度0~5.0 mmol/L内，P(Tria)对三唑酮的最大吸附量达到26.86 umol/g，超过了 P(B)对三唑酮的最大吸附量(13.50umol/g).从P(Tria)与P(B)对三唑酮吸附能力的差异可知三唑酮分子烙印聚合物对三唑酮具有更高的亲和力.为了更深入的研究 P(Tria)对印迹分子三唑酮的吸附特性，对P(Tria)的吸附数据用 Scatchard 模型进行分析，以便更好地评价分子印迹聚合物的结合特性. Scatchard 方程如下式口10.11] 其中 Ka代表结合位点的离解常数，Qmax代表最大表观结合量，[Tria]代表吸附液中三唑酮的平衡浓度，将获得的结合数据按上式作图可得 Scatchard图(见图3).在 Scatchard 图中 O/[Tria]对 O明显是非线性的，说明P(Tria)中的识别位点具有不同的作用性质，即结合位点并不是等价的.这一结果对于非共价型分子印迹聚合物是相当普遍的.因为在制备非共价型分子印迹聚合物时，印迹分子和功能单体之间可以用多种结合形成复合物，不同类型的复合物在聚合之后，就形成了具有不同性质的作用位点.从图3中 P(Tria)的Scatehard 图可看出，在有的两端有两个明显的部分分别有良好的线性关系，在测定的三唑酮浓度范围(0~5.0 mmol/L)内，印迹聚合物主要存在两类不同的结合位点112]，由两条直线的斜率和截距可求得高亲和力的结合位点的离解常数 Ka=7.89 ×10 mol/L ，最大表观结合量0max1=20.47 umol/g； 低亲和力的结合位点的离解常数 Ka2=3.53 ×10mol/L，最大表观结合量 Omax，2=47.17 umol/g.由图3中P(B)的Scatchard 图可以看出，空白聚合物中由于没有与模板分子匹配的结合位点结合能低低于烙印聚合物.在空白聚合物中没有与模板分子匹配的结合位点，是非特异性结合.进而说明烙印聚合物中主要存在的两类结合位点是特异性的结合位点.这种特异性的结合位点来源于聚合物与模板分子匹配的亲和作用，这种吸附位点是特定的，不是随机排列的单体官能团(α-甲基丙烯酸中的羧基).但是对于存在不同结合位点的印迹聚合物，采用Scatchard分析测定结合常数存在一定的近似性.当底物的浓度较高时，测定低亲合力的结合常数无法扣除高亲合力的贡献而使所得结果偏高.当底物的浓度低时，求测高亲合力的结合常数时，低亲合力的结合位点仍有贡献，只有底物的浓度极低时，低亲合力的结合位点的贡献可以忽略.而使用多点结合模型可克服这一缺点13]. 式中◎为底物的结合量， 0max，i为第i类结合位点的最大表观结合量，Ka，i为第i类结合位点的离解常数，c为溶液中底物的平衡浓度，m 表示印迹聚合物中共有m类结合位点.由于三唑酮分子印迹聚合物存在两类不同的结合位点，因此，式(1)可写为 使用式(2)对所得的实验数据进行曲线拟合(如图4). 由图4可见，所得的拟合曲线与实验数据能够很好地吻合，由拟合曲线得到的结合参数分别为8.06×10“mol/L， 31. 07 umol/g； 1.06 ×10-3mol/L：18.01 umol/g.以MAA 为功能单体的三唑酮分子印迹聚合物中两类结合位点产生的原因可能是在聚合前和期间在反应混合液中，功能单体 MAA 与三唑酮主要形成两种不同的络合物，这两种结构不同的络合物经交联剂交联均可进入聚合物母体中，因此在聚合物中形成了两种不同结合性质的结合孔穴. 2.3 P(Tria)的底物选择性 选用与三唑酮分子结构类似的三唑醇和吡虫啉为底物(结构式见图5)，以乙腈为溶剂，研究 P(Tria)对底物的选择性结合特性.称取洗涤好的粒状 P(Tria) 和P(B)聚 图4 由式(2)得的拟合曲线 Fig.4 Fitting curve obtained by equation(2) 合物各30.0 mg分别放入10mL磨口锥形瓶中，加入3.0 mL 2.0 mmol/L 的底物乙腈溶液，放入恒温水浴振荡器中，室温下振荡24h，然后过滤，用HPLC方法测定吸附液中底物的浓度.根据吸附前后溶液中底物浓度的变化计算聚合物对底物的吸附量.用平衡结合方法测定了印迹聚合物 P(Tria)及非印迹聚合物 P(B) 对底物的结合量.结果见表1. 吡虫啉 图5 3 种底物结构示意图 Fig.5 Molecular structures of three substrates 由表1可见，印迹聚合物对三唑酮的结合量是非印迹聚合物的1.5倍，印迹聚合物和非印迹聚合物对吡虫啉的结合容量都较低.这表明分子印迹技术提高了印迹聚合物的结合能力，在印迹聚合物中既有与三唑酮的官能团互补的功能基团，又有与三唑酮的立体结构互补的特定形状的孔穴，正是由于功能基和立体形状的同时作用，才使得 P(Tria)对三唑酮显示出特效的选择结合特性.说明该印迹聚合物有可能用于三唑酮的富集与测定. 表1 不同底物在 P(Tria)和 P(B)上的结合量 Tab.1 Binding amounts of tested substrates on P( Tria) and P(B) by batch method 底物 P(Tria)/ (umolg ) P(B)/(umolg) 三唑酮 16.21 10.42 三唑醇 7.06 5.35 吡虫啉 1.83 2.10 聚合物量30.0mg；底物初始浓度2.0 mmol/L；V=3.00 mL；吸附时间 24 h；室温25 3 结论 以氯仿为溶剂，采用分子印迹技术合成了三唑酮的印迹聚合物，该聚合物热稳定性强，机械稳定性高，对三唑酮呈现高的选择结合特性.三唑酮分子印迹聚合物的合成为食品中三唑酮的富集和测定奠定了良好的理论和实践基础.可望将其作为固相萃取剂，识别并分离富集食品中的三唑酮. ( 参 考 文 献： ) ( [1]史瑞雪，郭成海，邹小红，等.分子烙印技术研究进展[J].化学进展，2002，14(3)：182-191. ) ( [2] WULFF G， SARHAN A. Uber die anwendung von e nzymanalog egbauten pol y meren zur racematter nnung [J]. Angew Chem， 1972，84(8)：364-371. ) ( [3] ANDERSSONL， SELLERGREN B， MOSBACH K . Imprinti n g of amino acid derivati v es in macroporous polymers[J]. Te t r a -hed Lett，1984，25(45)：5211-5214. ) ( [4] VID YASN KEARS RU M，ARNOLD F H. Molec u l a rly imprinted lig-and-exchange adsorben t s for the chiral separ a tion of under-ivatized amino-aci d [J].J Chromatogr A ， 1997，775：51-63. ) ( [5 ] SUSANNE STR I EGL ER. Carbohydrate recognition in cross-linked sugar-templated poly(acrylates) [J]. M acromolecules， 2003 ， 36：1310- 1 317. ) ( [6] K EMPEM， M O SBA C H K. Direct res o lution of naproxen on a non-cova l ently molecularly imprinted chiral stationary phase [J]. J Chromatogr，1994b，664：276-279. (下转第404页) ) 表4 不同离子的饱和吸附量 Tab.4 Saturated adsorbance of different ions 元素 饱和吸附量/(10*mgm) 元素 饱和吸附量/(10ugm) Cu²+ 441.6 Fe3+ 183.2 Ni²+ 183.6 Zn2号 299.4 由表4可以看出不同离子的饱和吸附量相差很多，这是因为不同离子与-NH结合的稳定常数不同，稳定常数越大饱和吸附量也就越大. 3 结论 壳聚糖复合膜吸附金属离子[3]的过程中一部分金属离子是通过物理作用被吸附在壳聚糖表面，而另一部分金属离子主要是通过壳聚糖表面部分-NH提供孤对电子和具有空d轨道的金属离子形成配位键，所以壳聚糖复合膜对离子的吸附具有选择性，不同的离子吸附性能不同.可根据壳聚糖复合膜的这一特性应用在处理工业废水方面. ( 参 考 文 献： ) ( [1]王 茹，唐兰模.壳聚糖吸附水溶液中微量 Pb-+的研究 [ ].四川大学学报，2001，33(3)：55-57. ) ( [2]季君晖. Cu ² +壳聚糖螯合物及壳聚糖吸附 Cu²+机理的 XPS研究[J].应用化学，2000，17(1)：115-116. ) ( [3]郝志峰，杨 阳，余 坚，等.壳聚糖膜与Co(II) ，Ni( I I)，Cu(Ⅱl)复合物的 IR 光谱和 XPS谱[J].光谱实验室，2003，20 (6)：799-802. ) ( (责任编辑：梁俊红) ) (上接第400页) ( [7]周 杰，王善伟，郭洪声，等.原位分子印迹法制备的连续棒型模板聚合物的手性识别[J].分析化学，2000，28(3)：296 299. ) ( [8]杨更亮，蔡丽萍，刘树彬，等.多效唑分子印迹聚合物的制备及其识别特性[].河北大学学报，2006，26(3)：262-265. ) ( [9]LANCELOT G. H y dr o gen bonding between nucle i c acid bases and carboxylic acids[J]. J Am Chem So c ， 1 9 77 ，99(21)：7037- 7042. ) ( [10] L IDED R. CRC Hand book od Ch e mistry and Physics [M]. B o ca R a ton ：CRC P r ess， 1994：9-42. ) ( [11]郭洪声，何锡文，周 杰，等.药物氟哌酸分子模板聚合物的分子识别特性[J].分析化学，2001，29(2)：128-132. ) ( [12]吴文镶，李志伟，杨更亮，等.三唑醇分子烙印聚合物的吸附特性[J].河北大学学报，2004，24(6)：615-618. ) ( [13] RAMSTRVM O， ANDERSSON LI，MOSBA C H K. Recogniti o n s ites incorporating both pyridinyl and arboxy functi o nalities prepared by molecular imprinting[J].J Org Chem，1993 ，58：7562-756 4 . ) ( (责任编辑：梁俊红) ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net