西玛津、阿特拉津、西维因等5中农药中主要成分含量检测方案(毛细管电泳仪)

化学通报 2003年第3期·1192·http：//www.hxtb.org (下转第199页) ◆川◆◆业◆·◆川川● 研究简报 ◆ ◆川1川 重叠分辨图法用于毛细管电泳优化分离 张裕平 李向军 袁倬斌* (中国科学院研究生院化学部 北京 100039) 摘 要 采用重叠分辨图法对毛细管电泳的分离过程进行了研究，实验以扑草净等5种农药分离的条件为例，考察了影响分离的三个主要因素(溶液的 pH、表面活性剂浓度和有机改性剂浓度)对分离度的影响。分离过程首先通过11次初步实验建立目标函数，这样可预测其其条件下的最小分离度，从最终的重叠分辨图可得到分离的最佳条件。在选定的优化条件下，5种组分可达到基线分离。 关键词 胶束毛细管电泳 重叠分辨图 三嗪 西维因 Study on the Optimization Separation of Capillary Electrophoresisby Overlapping Resolution Mapping Zhang Yuping， Li Xiangjun， Yuan Zhuobin* (Department of Chemistry， Graduate School， Chinese Academy of Sciences， Beijing100039， China) AbstractThe separation process of high performance capillary electrophoresis was studied using overlappingresolution mapping scheme. The effects of three main factors on resolution including the concentration of surfactant，organic modifier and pH of the solution were investigated using 5 kinds of pesticides as a model such as simazine，atrazine， carbaryl， ametryne and prometryn. The destination functions were first established through 11 pre-plannedexperiments， which could draw the resolution mapping of each peak pair， and the optimum condition could beobtained from the final overlapping resolution mapping， which could assure the baseline-separation of 5 pesticidesunder the optimum condition. Key wordsSHigh performance capillary chromatography， Overlapping resolution mapping， Triazine， Carbaryl 作为分析化学的一个新兴领域，化学计量学已经成为现代分析化学工作者不可缺少的工具，其研究方向包括采样与检验、实验设计与优化、多元校正与分辨模式识别、专家系统等十几个分支，其中实验设计与优化就就一个热点。目前用于优化与实验设计的方法较多法1~4]，如单纯形优化、正交设计、均匀设计、重叠分辨图法等。由 Glajch 等151提出的重叠分辨图法在液相色谱的条件优化中应用较多，最初用来确定流动相最佳组成，使用该方法最少可通过7次实验确定流动相配比。邹汉法等L6曾将该方法成功地应用于梯度洗脱时的分离条件寻优。在毛细管电泳分离过程中，影响分离 ( 张裕平 男，33岁，博士生，现从事色谱及相关技术研究。 *联系人 ) ( 国家自然科学基金(20175025)、国家自然科学基金分析化学重点基金(20235010)、电分析化学国家重点实验室基金、“十五”国家重大科技攻关(2001BA210A04)资助项目 ) ( 2002-05-22收稿，2002-10-25修回 ) 的实验因素较多，要想获得满意的分离结果，有必要对这些因素进行优化。另外随着分离条件的改变，不同峰对之间的分离度可能会发生变化，出峰顺序有时也发生改变，最小的分离度可能会体现在不同的峰对上，而一般的优化方法均存在一定局限。基于此，本文尝试用重叠分辨图法对农业生产中常用的5种农药(见图1)的电泳分离过程进行优化，结果令人满意，5种农药在10min 内可达到基线分离。 图1 农药的分子结构 Fig.1 Molecular structure of pesticides 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 实验所用为 ACS2000 型高效毛细管电泳仪(中科院研究生院应用化学所)、高压电源(0~30kV)；Spectra 200 型可变波长(0~800nm)紫外检测器(美国热电集团)并装有 On-column 型专用毛细管流通池，压差式进样， 65cmx50um i.d.石英毛细管(河北永年光纤厂)，有效长度 54cm， pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。 西玛津、阿特拉津、扑草净标样由农业部环境保护监测研究所提供，莠灭津、西维因标标由湖南化工研究院提供。硼砂、醋酸、磷酸盐、甲醇、十二烷基硫酸钠(SDS)均为分析纯，实验采用石英二次蒸馏水。 1.2 样品准备 准确称取一定重量的农药标准品，配制 1000mg/L的储备液，分别移取一定体积的标准溶液于25mL的容量瓶中，再用50%的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后，再在超声波上超声15min，冷却后备用，工作液使用前稀释、配制成100mg/L的混合标准工作液。 1.3 实验方法 实验前首先用 0.1mol/L NaOH 冲洗毛细管 3min，再分别用去离子水和背景电解质溶液洗柱3min，采用阳极端手动压差进样，在选定实验条件下进行分离，每二次运行之间用背景电解质溶液洗柱 2min，分离进行5~6次后，更换两边缓冲液。 毛细管电泳工作条件如下：检测波长225 nm； 20mmol/L 硼砂-磷酸盐缓冲溶液，0~8%甲醇，0~60mmol/L SDS； pH=7.5~9.5；分离电压25kV；进样：位差10cm，10s；数据记录采用 ACS2000 软件；室温(19~21℃)。当混合标准溶液各组分达到基线分离时，采用分别提高单组分物质的浓度，根据其峰高的响应变化来对谱峰进行定性。 2 结果与讨论 2.1 优化策略 毛细管区带电泳分离的主要是那些在水溶液中呈离子态的或可离子化的化合物，其分离原理主要是基于化合物在形状或质荷比上的差异。西玛津、阿特拉津、扑草净、莠灭津均属氯取代的三嗪类农药，性质、结构相似，西维因属氨基甲酸酯类农药，它在农业生产中应用较为普遍。 Desiderio等171曾采用胶束毛细管色谱法测定了河水中的西玛津和阿特拉津， Schmitt 等L81采用区带电泳法分离了羟基、甲氧基取代的三嗪类农药。本文首先采用硼砂或醋酸盐作缓冲溶液进行分离研究，因分离物电泳迁移速度相近，通过区带电泳法不能分离，实验过程中通过改变分离电压、缓冲溶液的浓度及pH，分离仍然得不到改善。因此必须考虑采用胶束毛细管电泳模式。 采用胶束毛细管电泳法(MEKC)对复杂组分进行分离时需考虑许多因素，为保持优化实验的其它条件尽可能一致，实验过程中温度控制在19~21℃范围内，操作电压恒定为 25kV，毛细管柱长、柱内径的大小以及进样体积固定不变。 胶束假固定相主要作为一种分离的“载体”，其浓度的选择对于分离效果产生一定影响，其浓度选择下限必须高于其胶束浓度，上限必须考虑到焦耳热效应。实验过程胶束浓度控制在0~60mmol/L范围内。 有机溶剂加入到胶束体系中，一方面可防止水溶性极小的溶质在体系中产生沉淀，另一方面加入有机溶剂会减小流动相的极性，改善分离效果的目的。在考虑使各分离对象达到基线分离，保留时间不至于过长的情况下，本实验添加甲醇最大含量为8(vol)%。 8 溶液 pH能强烈影响熔硅毛细管的表面特性，在pH4~6范围内，—Si-OH 基的电离对pH 非常敏感，表面电荷变化非常大，EOF 对 pH 有很强的依赖性，因此本文在弱碱性条件下进行实验。按 HPCE 分离过程的经验，实验主要考虑三个重要因素如甲醇添加剂的浓度(x)缓冲溶液的pH(x2)、SDS(x3)对分离的影响。采用重叠分辨图法按表1安排实验(其模型见图2)，在正方体的八个顶点上各安排1次实验， 图2111次初步实验的立体定位 Fig.2 Cubic location of 11 pre-planned experiments 同时在x1x2>x3轴的中点各安排1次实验，一共有11次初步实验。 表1 得到重叠分辨图所必需完成的初步实验 Tab.1 Pre-planned experiment condition carried out to obtain the ORM 编号 甲醇x/% pH(x2) 十二烷基硫酸钠(x3，mmol·L-1) 百分比 1 0 7.5 30 0，0，0 7.5 1，0，0 3 0 9.5 0，1，0 4 0 7.5 0，0，1 5 8 9.5 1，1，0 6 8 9.5 1，0，1 0 9.5 0，1，1 8 8 9.5 1，1，1 9 7.5 0.5，0，0 8.5 0，0.5，0 0 7.5 0，0，0.5 优化过程以两个相邻峰之间的分离度为响应函数，各个峰对的分离度按式(2)计算，考虑到三因素之间可能的交互作用，分离度可按以下模型建立经验关系式： 其中 aj(aovaq等)是多项式的系数，x；(xx2x3)是图2模型中的各变量的百分比。R是相邻峰的分离度， tj、t2分别为相邻两峰之间的迁移时间， wjwz 为相邻两峰之间的峰宽。 初步实验的计算结果如表2所示，从表中的11次实验可看出，在选定的实验条件下，第11次实验的结果最好，在分离的5种农药中，可得到4个分离度，最难分离的一对峰为西玛津和阿特拉津，可能是由于其结构非常相似，仍然没有达到基线分离，分离度为0.95，因此有必要再次寻优。 表2 按表1初步实验所得相邻峰的分离度结果 Tab.2 Results of Resolution(R) between adjacent peaks according to the pre-planned experiments listed in Tab.1 R 实 验 编 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 R1-2 0.46 0.92 1.0 1.3 0 1.8 1.2 2.6 0.64 0.87 0.95 R2-3 0.95 1.7 1.8 1.4 3.2 2.7 4.9 3.7 1.7 1.1 1.2 R3-4 0.67 0.94 2.3 2.1 1.4 1.2 1.5 0.67 1.0 1.1 1.2 R4-5 0.32 0.89 0.78 0.91 1.3 0.87 0.76 2.4 0.67 0.49 1.3 通过11次实验可确定每个峰对的多项式方程中的系数 aoaja2ia3儿川11a22a33a12a23a13123的值，一旦以上系数值确定，在参数空间的任意两个相邻峰之间分离度就可预测出来，采用Mathematica 软件对多项式方程进行拟合(计算过程此处省略)，可以得到所有峰对的多项式方程(系数见表3)。 表311次实验所得方程(1)的系数 Tab.3Coefficients of Eq(1) for the 11 experiments 方 程 系 数 a0 d1 02 d3 a12 13 d23 d11 022 a33 d123 R1-2 0.46 1.12 0.26 1.1 0.04 -0.64 -1.46 -0.28 0.2 -0.56 2.36 R2-3 0.95 0.55 2.25 -0.25 0.55 2.65 0.65 -0.1 -1.5 1.1 -3.15 R3-4 0.67 0.69 1.05 0.09 -1.17 -2.23 -1.1 0.74 -0.78 1.54 1.24 R4-5 0.32 3.33 0.83 0.22 -0.61 -0.61 -0.05 -2.74 -0.26 0.24 1.73 根据所确定的多项式方程，采用 Matlab 所编制程序，可以得到初步实验点外的分离度。如果将每个峰对的最小分离度画图，同时将这些分辨图叠加在参数空间上，就可以在最终的重叠分辨图上找出最优的分离条件范围或最大值。与三角重叠分辨图不同的是，该方法容易得到每个峰对的三维立体表现，但必须在选择的三个参数间固定某一某数，图3就是固定甲醇含量为8%(x=100%)时每组峰对的三维立体图，图4是最后的重叠分辨图，它是由A、B、C和D4张分辨图在空间叠加，同时将分离度取最小值所得。从图4可以直观看出，分离度的立体曲面向水平面投影可以得到不同分离度的取值范围所对应的变量值的区间，水平面上箭头所指为获得分离度最佳值区域(R>1.2)，该区域内所对应的因素水平能使各组分得到较好的分离，R...能满足定量分析的要求。立体 曲面上箭头所指为最大的分离度值，此点对应的变量值可通过计算机编程计算，也可通过该图近似估计。 图3 四组峰对的重叠分辨图的三维表现 Fig.3 Three-dimenstional representation of the overlapped resolution of 4 peak pairsR代表分离度，A、B、C、D分别代表峰对1-2，2-3，3-4，4-5。 图5 标准混合液的毛细管电泳图 Fig.5 Electropherograms of a mixture of standards under MECC 图4 所有峰对重叠分辨图的三维表现 实验条件：缓冲溶液 60mmol/L SDS-20mmol/L 硼砂-磷酸盐-8%甲醇， pH=8.24，操作电压25kV，检测波长 Fig.4 Three-dimenstional representation of the finaloverlapped resolution of all peak pairs 225mm；峰序与图1相同 2.2 二羟基-18-冠-6(3a，3b)的制备 采用硫酸/水体系和硝酸铜/氧化铜/水体系进行二重氮氟硼酸盐(2a，2b)的水解反应都未得到满意的结果。另外，笔者也尝试过二重氮硫酸盐的热分解反应L81，但反应收率不及二重氮氟硼酸盐，文献记载和笔者的实验收率都不超过 39%，并且产物的颜色较深，不便于精制。本文用二重氮氟硼酸盐代替二重氮硫酸盐，并用纯水水解，不仅提高了收率(50%以上)，而且粗产物的颜色好，有利于分离精制，是一种制备顺反异构的二羟基-18-冠-6的方便方法。 关于利用顺反异构的二羟基-18-冠-6为单体的功能高分子的合成研究正在进行之中。 ( 参 考 文 献 ) [1] C J Pedersen. 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