中药月季中毛细管电泳指纹图谱的研究检测方案(毛细管电泳仪)

潍坊学院学报Journal of Weifang UniversityVol. 7 No. 2Mar.2007第7卷第2期2007年3月 第2期刘海兴，曹丽曼，万丽梅等：中药月季毛细管电泳指纹图谱的研究 中药月季毛细管电泳指纹图谱的研究 刘海兴，曹丽曼，万丽梅，李丽敏，张运臣(潍坊学院，山东 潍坊 261061) 摘 要：通过改变硼砂溶液的浓度、运行电压、溶液酸度，分析图谱峰的优化分离条件，从而确定定砂溶液浓度20 mmol/L、运行电压20kVpH值为8.88。添加剂乙醇、乙腈不能有效地分离峰，而添加甲醇能够做到对各峰的有效分离，且峰形较好。又通过改变甲醇浓度，分析后确定甲醇体积分数为20%。从而建立了中药月季花的 HPCE指纹图谱分析条件，初步拟定指纹特征图谱指标，为月季花药材内在质量评价积累数据。结果共标示出23个共有峰，以此23个共有峰分析， HPCE指纹图谱的精密度、稳定性、重现性良好。此方法准确、可靠、稳定性好，可作为中药月季花的 HPCE指纹图谱。 关键词：HPCE；指纹图谱；月季 中图分类号：0658 文献标识码：A 文章编号：1671-4288(2007)02-0074-06 引言 月季花，气味甘温，无毒，主治活血、消肿、解毒。花含挥发油，其主要成分为橙花醇、香茅醇、=牛儿醇及其葡萄糖苷等，还含有皮素、鞣质、没食子酸、色素等。具有活血调经，散毒消舯之功效。其叶捣烂外敷，可治跌打损伤。 毛细管电泳以其特有的优势，近年来在药物分析中应用广泛[1-6]。本实验直接采用中药月季花粉末水浴加热提取有效成分，方便、快捷、成本低，获得的电泳指纹图谱重复性、稳定性良好，可用于中药月季内在品质的鉴别。目前月季花药材电泳指纹图谱尚未见文献报道。 2 仪器与试剂 2.1 仪器 高效毛细管电泳仪(CL1030北京彩陆科学仪器有限公司)，色谱工作站(南京千谱)，电子天平(FA2004N上海精密科学仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(HH-4江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，精密酸度计(pHS-3B上海虹益仪器仪表有限公司)，未涂层石英毛细管(75um内径、总长56cm、有效长度48 cm)(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。 2.2 试剂 乙醇(95%)硼砂(分析纯)、甲醇(分析纯)， 月季花1(河南产，购自潍坊本草堂大药房)、月季花2(河南产，购自潍坊远东大药房)、月季花3(河南产，购自潍坊颐卜生药房)、月季花4(河南产，购自潍坊民康药房)、月季花5(河南产，购自潍坊远东大药房)、月季花6(山东潍坊)。 3 方法 3.1 实验过程 实验前，毛细管柱依次用1.0 mol/L 盐酸溶液、重蒸馏水、1.0 mol/L氢氧化钠溶液、重蒸馏水和硼砂-甲醇缓冲溶液各冲洗8 min。每两次运行间毛细管用缓冲溶液冲洗4min，两次运行后毛细管再次用上面的方法冲洗。紫外检测波长为254 nm，实验温度为15℃，重力进样时间为6s ，进样高度为7.5cm。 3.2 样品试液制备 依次精确称取月季花粉末1.0672 g、1.0464g-1.0673 g-1. 0673 g-1.0693 g1.0190 g(前五种均为河南产，第六种为山东产)，置于磨口锥形瓶中，加入25mL 乙醇，水浴60℃加热提取2.5h，过滤、洗涤，并定容至25mL容量瓶中，依次得到月季1、月季2、月季3、月季4、月季5、月季6样品试液。 3.3 确立缓冲溶液添加剂及典型的指纹图谱的条件 ( *收稿日期：2007-01-16 ) ( 作者简介：刘海兴(1963-)，男，河北抚宁人，潍坊学院化学化工系副教授，博士。 ) 配制浓度为10、20、30、40、50 mmol/L的硼砂溶液，运行样品溶液。实验表明，随着硼砂浓度增加，许多峰迁移时间延长。在硼砂浓度为20mmol/L时，峰形较其它浓度时要好，峰个数也相对较多；而硼砂浓度高于30 mmol/L时，月季样品溶液吸附有些加重，峰有些加宽。虽然一般情况下，增加浓度有利于增加缓冲容量，改善分离，但对此样品溶液却不太明显。故选择20mmol/L的硼砂溶液为基础。 在20 mmol/L的硼砂溶液的基础上，配制了pH分别为7.84、8.36、8.88、9.36、9.85、10.35的硼砂溶液，在pH 为9.36以上，样品峰形较差，迁移较慢的峰吸附稍严重些，而有些峰重叠现象也较明显。可能是此样品组分在pH较高时与毛细管壁有较强的作用。当pH低于8.36时，谱峰分离也不太理想；在pH为8.88时，谱峰相对较好，数目也较多；但仍有几个峰(图1)有部分重叠现象；所以选pH为8.88的溶液进行下一步的探索。 在硼砂溶液浓度20 mmol/LpH8.88的条件下，甲醇含量对样品组分分离的影响作了考察。当甲醇含量依次为5%10%、15%、20%、25%(v/v)时，样品组分分离逐步得到改善，甲醇含量达到20%时，重叠峰基本达到分离；甲醇含量高于20%时，组分分离情况反而稍差。因此20%的 甲醇含量，就是获得样品溶液最佳电泳分离谱图的含量。也曾试验过添加剂乙醇、乙腈对样品组分分离的影响，但结果都不理想。 通过电压考察，选择了20 kV。最终确定的电泳条件为：硼砂溶液浓度20 mmol/L，pH8.88，甲醇含量20%(v/v)，运行电压20kV。典型的样品溶液分离图谱见图1。 4 方法考察[7-11] 在优化的毛细管电泳分析条件下，运行样品溶液，获得电泳图谱。在图谱中选择一个特定峰，该峰具有位于电泳图谱较中心位置，有较高浓度，为所有样品所共有特征。此峰作为参照峰，求出其他所有峰的相对迁移时间 α(α=ti/ts)，相对峰面积S(S=Ai/As)。其中 ti、ts分别为待测峰及参考峰的迁移移间；Ai、As分别为待测峰及参考峰的峰面积。基于月季1电泳图谱峰总面积较大，峰数较多，具有代表性，故将其指定为参比样品。 图1是实验获得月季1样品溶液的毛细管电泳指纹图谱。 4.1精密度试验 在电泳缓冲液条件下，运行7次月季1样品溶液。记录迁移时间和峰面积。精密度实验结果列于表1和表2。以12号峰为参照峰。 表 1 精密度试验结果(相对迁移时间) 次 峰 数 2 3 4 5 6 7 X(平均值) RSD(%) 号 1 0.5646 0.5675 0.6269 0.5315 0.5723 0.5310 0.6272 0.5656 6.2 2 0.6635 0.6677 0.6726 0.6352 0.6676 0.6204 0.6903 0.6596 3.6 3 0.6820 0.6897 0.6940 0.6592 0.6841 0.6403 0.7100 0.6799 3.4 4 0.6915 0.6991 0.7011 0.6652 0.6940 0.6519 0.7177 0.6886 3.3 5 0.6807 0.7038 0.7318 0.6706 0.7218 0.6525 0.7475 0.7012 5.0 6 0.6911 0.7068 0.7389 0.6754 0.7284 0.6540 0.7486 0.7062 4.9 7 0.7950 0.7994 0.8078 0.7701 0.7989 0.7012 0.8220 0.7849 5.1 8 0.8111 0.8150 0.8257 0.7877 0.8156 0.7237 0.8367 0.8022 4.7 9 0.8265 0.8244 0.8363 0.7996 0.8273 0.7468 0.8475 0.8155 4.1 10 0.8959 0.8913 0.9004 0.8810 0.8900 0.9085 0.9015 0.8955 1.0 11 0.9198 0.9131 0.9253 0.9109 0.9218 0.9246 0.9297 0.9207 0.7 12 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 13 1.0195 1.0157 1.0178 1.0180 1.0196 1.0177 1.0142 1.0176 0.2 14 1.0304 1.0282 1.0285 1.0334 1.0324 1.0411 1.0250 1.0313 0.5 15 1.0564 1.0533 1.0499 1.0697 1.0600 1.0747 1.0429 1.0581 1.1 16 1.2325 1.2223 1.2192 1.2845 1.2564 1.3242 1.1938 1.2476 3.6 17 1.2668 1.2604 1.2427 1.3299 1.2991 1.3674 1.2146 1.2830 4.1 18 1.3125 1.3133 1.2836 1.3356 1.3769 1.3834 1.2490 1.3221 3.7 19 1.3448 1.3351 1.3203 1.4208 1.4809 1.4245 1.2830 1.3728 5.1 20 1.4942 1.4835 1.4404 1.5736 1.5664 1.6734 1.4397 1.5245 5.6 21 1.6035 1.5926 1.5267 1.6149 1.7151 1.6921 1.4961 1.6059 5.0 22 1.8920 1.8051 1.7480 1.7471 1.8480 1.7126 1.5178 1.7529 6.9 23 2.0696 1.8882 1.8943 1.8025 1.9478 1.8351 1.6591 1.8709 6.8 次 峰 数 1 2 3 4 5 6 7 X(平均值) RSD(%) 号 1 0.0738 0.0781 0.0621 0.0700 0.0648 0.0733 0.0722 0.0706 7.8 2 0.2859 0.2897 0.2393 0.2772 0.2492 0.2959 0.2702 0.2725 7.8 3 0.0455 0.0496 0.0421 0.0456 0.0425 0.0482 0.0497 0.0461 6.8 4 0.0372 0.0319 0.0345 0.0344 0.0336 0.0358 0.0337 0.0344 5.0 5 0.0461 0.0433 0.0424 0.0492 0.0446 0.0388 0.0410 0.0436 7.8 6 0.0402 0.0424 0.0425 0.0359 0.0349 0.0374 0.0411 0.0392 8.0 7 0.3425 0.3276 0.3553 0.3307 0.2922 0.3586 0.3228 0.3328 6.8 8 0.1346 0.1251 0.1286 0.1118 0.1140 0.1299 0.1198 0.1234 6.9 9 0.2776 0.2603 0.2353 0.2468 0.2238 0.2744 0.2460 0.2520 7.9 10 0.2285 0.2216 0.2281 0.2295 0.2113 0.2495 0.2021 0.2244 6.7 11 0.2457 0.2257 0.2620 0.2509 0.2180 0.2413 0.2251 0.2384 6.7 12 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 13 0.1091 0.1088 0.0905 0.0983 0.1093 0.1128 0.1119 0.1058 7.8 14 1.0842 1.0643 1.0445 1.1935 1.0072 1.0744 1.0543 1.0746 5.4 15 3.1731 3.1909 2.7963 2.9352 2.7591 2.7223 2.6056 2.8832 7.9 16 0.2114 0.2211 0.2047 0.2460 0.2337 0.2132 0.2000 0.2186 7.5 17 0.1412 0.1466 0.1161 0.1276 0.1304 0.1235 0.1279 0.1305 8.0 18 0.1647 0.1613 0.1503 0.1687 0.1565 0.1828 0.1776 0.1660 6.9 19 0.1304 0.1453 0.1562 0.1571 0.1649 0.1583 0.1472 0.1514 7.5 20 0.7546 0.8305 0.6921 0.6912 0.7629 0.8016 0.6888 0.7460 7.7 21 0.2374 0.2269 0.2164 0.2622 0.2238 0.2490 0.2647 0.2400 7.9 22 0.6451 0.6707 0.5877 0.5724 0.6654 0.5930 0.6374 0.6246 6.3 23 0.1573 0.1407 0.1397 0.1535 0.1234 0.1463 0.1472 0.1440 7.7 4.2 稳定性试验 月季1样品溶液连续四天进样，间隔24h。记录迁移时间和峰面积，结果分别列于表3和表4中。以12号峰为参照峰。 表3 稳定性试验结果(相对迁移时间) 峰 次 数 1 2 3 4 X(平均值) RSD(%) 号 1 0.5916 0.5878 0.5861 0.5646 0.5825 2.1 2 0.6873 0.6843 0.6848 0.6635 0.6800 1.6 3 0.7067 0.7022 0.7091 0.6820 0.7000 1.8 4 0.7141 0.7136 0.7496 0.6915 0.7172 3.4 5 0.7248 0.7354 0.7721 0.7276 0.7400 3.0 6 0.7351 0.7605 0.7860 0.7462 0.7570 2.9 7 0.8180 0.8106 0.8070 0.7950 0.8076 1.2 8 0.8345 0.8241 0.8246 0.8111 0.8236 1.2 9 0.8444 0.8343 0.8333 0.8265 0.8346 0.9 10 0.9021 0.9038 0.8987 0.8959 0.9001 0.4 11 0.9293 0.9205 0.9107 0.9198 0.9201 0.8 12 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 13 1.0126 1.0160 1.0110 1.0195 1.0148 0.4 14 1.0304 1.0265 1.0175 1.0304 1.0262 0.6 15 1.0532 1.0501 1.0351 1.0564 1.0487 0.9 16 1.2006 1.2003 1.1754 1.2325 1.2022 1.9 17 1.2208 1.2305 1.2038 1.2668 1.2305 2.2 18 1.2562 1.2683 1.2370 1.3125 1.2685 2.5 19 1.2893 1.2870 1.2547 1.3448 1.2939 2.9 20 1.3789 1.4095 1.3687 1.4942 1.4128 4.0 21 1.4495 1.4810 1.6142 1.6035 1.5370 5.5 22 1.6034 1.6741 1.7898 1.8920 1.7398 7.3 23 1.7197 1.8041 1.9120 1.9655 1.8503 5.9 表4 稳定性试验结果(相对峰面积) 峰 次 数 1 2 3 4 X(平均值) RSD(%) 号 1 0.0585 0.0608 0.0618 0.0686 0.0624 6.9 2 0.1945 0.2209 0.1930 0.2234 0.2080 7.9 3 0.0450 0.0517 0.0452 0.0455 0.0468 6.9 4 0.0580 0.0658 0.0633 0.0692 0.0641 7.3 5 0.0266 0.0298 0.0271 0.0286 0.0280 5.1 0.1262 0.1467 0.1342 0.1309 0.1345 6.5 7 0.3156 0.3451 0.3727 0.3425 0.3440 6.8 0.1292 0.1305 0.1361 0.1433 0.1348 4.8 0.2695 0.2939 0.2926 0.2919 0.2870 4.1 0.2120 0.2218 0.1932 0.2285 0.2139 7.2 0.2932 0.2941 0.2595 0.2745 0.2803 5.9 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 0.0789 0.0827 0.0865 0.0876 0.0840 4.7 0.9710 0.9618 1.1115 1.0842 1.0321 7.4 3.2058 3.0392 3.5936 3.1730 3.2529 7.3 0.2406 0.2353 0.2098 0.2114 0.2243 7.] 0.1490 0.1370 0.1341 0.1467 0.1417 5.1 0.0425 0.0437 0.0474 0.0485 0.0455 6.4 0.1418 0.1686 0.1608 0.1595 0.1577 7.2 3.1588 3.6205 3.4668 3.1851 3.3578 6.7 0.2057 0.2221 0.2116 0.2374 0.2192 6.3 1.2939 1.1228 1.1140 1.2265 1.1893 7.3 0.3445 0.3395 0.3305 0.3030 0.3294 5.6 4.3重复性试验 进样月季234、5、6样品溶液，进行重复性实验。记录迁移时间和峰面积，结果分别列于表5和表6中。以12号峰为参照峰。 表5 重复性试验结果(相对迁移时间) 样 峰 品 编 2 3 4 5 6 X(平均值) RSD(%) 号 号 1 0.5854 0.5862 0.5861 0.5612 0.5670 0.5772 2.1 2 0.6798 0.6820 0.6817 0.6579 0.6684 0.6740 1.6 3 0.6999 0.6972 0.7022 0.6776 0.6910 0.6936 1.4 0.7079 0.7044 0.7095 0.6862 0.7006 0.7017 1.3 5 0.7278 0.7349 0.7420 0.7267 0.6808 0.7225 3.3 6 0.7398 0.7558 0.7671 0.7408 0.7529 0.7513 1.5 7 0.7551 0.8161 0.8158 0.7930 0.8089 0.7978 3.2 8 0.7597 0.8314 0.8313 0.8092 0.8256 0.8115 3.7 9 0.7652 0.8429 0.8429 0.8201 0.8363 0.8215 4.0 10 0.9012 0.8941 0.9009 0.8908 0.9168 0.9008 1.1 11 0.9359 0.9238 0.9288 0.9166 0.9394 0.9289 1.0 12 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 13 1.0169 1.0153 1.0159 1.0186 1.0324 1.0198 0.7 14 1.0295 1.0306 1.0276 1.0289 1.0624 1.0358 1.4 15 1.0521 1.0498 1.0574 1.0549 1.0917 1.0612 1.6 16 1.2286 1.2176 1.2112 1.2424 1.2896 1.2379 2.5 17 1.2517 1.2394 1.2366 1.2735 1.3309 1.2664 3.1 18 1.2786 1.2720 1.2993 1.3439 1.3998 1.3187 4.0 19 1.3019 1.2951 1.3822 1.4563 1.5249 1.3921 7.1 20 1.3672 1.3624 1.4099 1.5028 1.5898 1.4464 6.8 21 1.4988 1.6383 1.6610 1.7529 1.7065 1.6515 5.8 22 1.6920 1.6848 1.7851 1.8376 1.7562 1.8370 6.7 23 2.1528 2.1847 2.1276 2.1786 2.1247 2.0611 4.5 表6 重复性试验结果(相对峰面积) 样 峰 品 2 3 4 5 6 X(平均值) RSD(%) 号 编 号 1 0.1354 0.1376 0.1426 0.1367 0.1367 0.1378 2.0 2 0.2405 0.2359 0.2512 0.2629 0.2829 0.2547 7.4 3 0.0725 0.0742 0.0722 0.0752 0.0749 0.0738 1.8 4 0.0332 0.0338 0.0349 0.0336 0.0338 0.0338 1.8 5 0.0411 0.0460 0.0457 0.0442 0.0450 0.0444 4.4 6 0.1732 0.1621 0.1729 0.1824 0.1730 0.1727 4.2 7 0.3282 0.3307 0.3210 0.3490 0.3538 0.3365 4.2 8 0.1124 0.1243 0.1264 0.1112 0.1198 0.1188 5. 7 9 0.2794 0.2744 0.2789 0.2595 0.2853 0.2755 3.5 10 0.2359 0.2392 0.2328 0.2485 0.2341 0.2381 2.6 11 0.2725 0.2684 0.2881 0.2782 0.2579 0.2730 4.1 12 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0 13 0.1541 0.1791 0.1626 0.1627 0.1717 0.1660 5.8 14 0.9853 0.9282 0.8773 0.9581 0.9548 0.9408 4.3 15 2.6785 2.5305 2.9753 2.8084 2.7991 2.7584 6.0 16 0.2161 0.2087 0.2254 0.2300 0.2440 0.2248 6.0 17 0.1625 0.1636 0.1576 0.1821 0.1701 0.1672 5.7 18 0.1439 0.1461 0.1525 0.1606 0.1424 0.1491 5.0 19 0.8263 0.9590 0.9923 0.9076 0.9133 0.9197 6.8 20 1.4710 1.4882 1.4362 1.3990 1.4248 1.4438 2. 5 21 0.2623 0.2430 0.2245 0.2155 0.2297 0.2350 7.8 22 0.9912 0.9060 0.9175 0.9396 0.9755 0.9460 3.9 23 0.3249 0.3438 0.3940 0.3696 0.3540 0.3573 7.3 5 结论 实验考察了不同缓冲液添加剂、电压、酸度等因素对中药月季花毛细管电泳指纹图谱的影响，确立了图谱的建立条件。该指纹图谱得到了月季花药材所含组分的大量信息，能反映其内在品质，可用于中药月季花品质的鉴别。 ( 参考文献： ) ( [1]Liu H.X. ，S hi Y. 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An electrolyte containing 20mmol/L borate buff-er with methanol of 20 %(v/v) (pH8. 88) was used. A fused-silica capillary with an internal diameterof 75 ? m and a total length of 56 cm and effective length of 48 cm were used. Sample was injected for6 s. Temperature was 15℃ Under these conditions， 23 common peaks in the fingerprint were indica-ted.The present method is simple ，low cost and suitable for the quality assessment of Chinese ro se.Key words ：capillary electrophoresis ， fingerprint chromatography， chinese rose ：China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net