石杉碱甲单体中制备过程检测方案(高速逆流色谱)

的提取物活性，以前者的活性较为明显8]。乙醇提取法是中草药提取的常用方法，含水醇提取既能溶出极性较大的水溶性成分，也能溶出极性较小的成分。我们正进一步用不同极性的有机溶剂将高活性提物作分配处理及跟踪分离有效部位的成分。 比较相同提取物对标准菌和耐药菌的活性强度发现，对标准菌活性较大的提取物对耐药菌也具有较大的活性，说明中草药的抗菌机制可能与现有抗生素不同。有研究者认为中草药除直接抗菌外，还可增强机体的免疫力，这可能是中草药不易产生耐药性的原因之一。至于这些中草药提取物在体内的抗菌活性如何，尚需进一步研究。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 马翔宇，易龙，宋治远.医源性MRSA感染及其防治研究进展 [J] . 临床医学，2003，23(5)：53. ) ( [2] 王嵩.中草药抗细菌感染的研究[J].北京中医杂志，2002，21 (4)： 2 49. ) ( [3] 肖丽英，黄焯坡.23种中草药对耐药金葡菌的敏感性探讨 [J].时珍国医国药2001，12(10)：878. ) ( [4] 黄通旺，杨灏强，庞珊.抑制β内酰胺酶的草药的筛选研究[J].汕头大学学报(自然科学版)，2000，15(2)：46. ) ( [5 ] 徐 叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生 出版社，1982：106-1071. ) ( [6] 钟有添，马廉兰.中草药和常用抗生素对绿脓杆菌的抑菌实 验[J].赣南医学院学报，2001，21(3)：244. ) ( [7] 蒋丹，王关林.22种中草药抑菌活性的研究[J].辽宁高职学 报，2003，5(4)：140. ) ( [8] 马廉兰，张文平，曾祥凤，等.116种中草药对白念珠菌的抑菌 实验[J].赣南医学院学报，1998，18(3)：189. ) ( 收稿日期：2005-03-14 ) 高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体 陈建华，黄少烈，李忠(华南理工大学化工与能源学院广东省绿色化学产品技术重点实验室，广州510640) 摘要：目的 从千层塔植物提取物中分离制备石杉碱甲单体。方法 利用高速逆流色谱技术，通过寻找合适的两相溶剂体系及工艺参数，研究及讨论石杉碱甲分离制备的新方法。结果 以n-Hexane/nBuOH/H，O(4：15，V/V/V)为两相溶剂体系，在优化的工艺参数条件下，利用高速逆流色谱技术，获得了单体纯度为98.6%(HPLC)的石杉碱甲单体。结论 利用高速逆流色谱技术成功地从千层塔植物提取物中分离制备了纯纯高于98%的石杉碱甲单体。 关键词：高速逆流色谱 (HSCCC)；石杉碱甲；千层塔(蛇足石杉)；植物单体制备 中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1007-7693(2006)04-0295-03 Prepare Huperzine A by High-speed Coun tercurrent Chroma tography CHEN Jian-hua， HUANG Shao-lie， L I Zhong(School of Chen ical & Enengy Engineering， South China University of Technolo-gy， Guangzhou 510640， China) ABSTRACT：OBJECTIVE Prepare Huperzine A from herb extract of Huperzia serrata Thunb (Trey ). METHODS Using thetechnology of HSCCC， research and discuss a new preparative method of Huperzine A by searching a suitable two-phase solvent systemand relative technical parameters RESUL TS Using n-Hexane/nBuOH/H，O (4 ：1 5，V//V) as the two-phase solvent system，Huperzine A with the purity of 98. 6% (HPLC) was successfully obtained under the op tim ized HSCCC conditions CONCLUSDNHSCCC was successfully used for the preparation of Huperzine A from Huperzia serrta Thunh (Treu ) at over 98% purity KEY WORD S： High-speed Countercurrent Chromatography (HSCCC)； Huperzine A； Qianceng Ta (Huperzia serrata Thunb(Trev )； Prepare monomer fiom Natural Herb 高速逆流色谱 (High-speed Countercurrent Chromatogra-phy，简称 HSCCC)技术是一种较为新型的无固体支撑的液-液分配色谱技术，由美国国立健康研究院 (National InstituteofHealth，U. S A) Ito博士最先研制开发。它利用螺旋管分离柱在做行星式运动时形成的单向性流体动力平衡体系，使 得互不混溶的两相溶剂不断混合，同时保留其中的一相作为色谱分离的固定相，而另一相在恒流泵的作用下连续输入作为色谱分离的流动相，从而在螺旋管柱内形成固定相与流动相连续的两相分割与对流趋势，实现连续、高效的液液分配过程。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天 然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域2。20世纪90年代以来，高速逆流色谱技术被广泛地应用于天然药物成分的分离制备与分析鉴定中33。 石杉碱甲是从中国特有植物千层塔(蛇足石杉)中提取的一种生物碱，是中国独创的一种世界级新药，属于可逆性胆碱酯酶抑制剂，是目前治疗良性记忆障碍和早老性痴呆症最为安全有效的药物之一【45]。石杉碱甲单体在千层塔植物干燥全草中的含量约为0.02%，且常伴有成分复杂、结构相似的共生生物碱，应用常规的分离方法难以大量获得16]。目前采用的生产方法为溶剂法，产品得率低，生产周期长17-11]。有机合成石杉碱甲由于技术问题，目前尚未获得突破[12-131。 利用现代高新分离技术——；高速逆流色谱，以千层塔植物提取物为原料，对石杉碱甲单体的制备进行研究，获得重大突破，取得一种分离周期短、产品纯度高、分离量大且稳定的工艺路线。本论文将对这一研究成果作一简要的介绍，而与本课题相关的分项研究，如高速逆流色谱溶剂体系的选择、分离样品的预处理、高速逆流色谱主要工艺参数(温度、转速及流速)的优化及工艺的产业化拓展研究(上样量及两相溶剂体系的单独配制)等将在其他论文中陆续发表。 仪器及试剂 高速逆流色谱系统：TBE300A高速逆流色谱主机+AK-TA Prime系统(主要含泵、检测器及收集器等)+MultiTempⅢ恒温水浴 +Prie View 2.0色谱工作站，上海同田生化技术有限公司 +Amersham Phammacia B iotech；高效液相色谱系统：HP1100 +HP ChemStation， HP Comoration。千层塔植物提取物：约5%石杉碱甲含量，宁波立华制药有限公司；石杉碱甲对照品：99.1%石杉碱甲含量，宁波立华制药有限公司；n-Hexane，n-BuOH， Triethano lam ine均为分析纯；Methanol：HPLC色谱纯；双蒸水及反渗透水均为自制获得。 2高速逆流色谱分离实验 2. 1 实验步骤 取 n-Hexane，nBuOH及 H0按415的比例配制约2000mL的两相溶剂体系，并于室温下平衡过夜；根据石杉碱甲的结构特性，利用一定的方法把千层塔植物提取物处理成石杉总碱；取少量石杉总碱用高速逆流色谱溶剂体系配制样品溶液；按如下“22"的工作流程进行高速逆流色谱分离实验。 2. 2 工作流程 图11高速逆流色谱实验的工作流程 Fig 1 Flow chart ofHSCCC experiment ·296· Chin JMAP， 2006 August， Vol 23 No. 4 图1表示出了本研究工作所采用的高速逆流色谱系统的工作流程。实验过程中，溶剂在泵的作用下经过六通上样阀，按一定的通路，进入水平行星式高速旋转的螺旋管分离柱中，样品在其中进行分配分离，流分通过紫外检测器等进行检测，并通过分布收集器收集，实验过程的参数及实验结果通过色谱工作站监控并记录。本研究工作根据选定溶剂体系的特性，首先采用正向洗脱方式把目标组分及其周围的组分洗脱出分离管柱，之后把仪器的运作方式切换为反向洗脱，以把存留在管柱里的易溶于固定相的组分洗脱出来，这种操作方式即有利于缩短分离时间又有利于降低多次实验间的相互影响。 2. 3 分离结果 利用选定的溶剂体系—n-Hexane-nBuOH-H，O(4：1：5)及优化后的高速逆流色谱工艺参数(螺旋管柱转速700r/min正向洗脱；流动相流速 2.0mL/m in；恒温水浴循环水温度45℃；紫外检测波长280mm；另外反向洗脱时螺旋管的转速依然为700r/min)上样 386mg石杉总碱进行高速逆流色谱分离实验，其结果如图2所示，其中实线为紫外检测分离的色谱图结果、点画线为电导检测分离的色谱图结果、虚线为上相溶剂的体积百分率曲线。 图2 石杉总碱在选定条件下的HSCCC分离谱图 Fig 2 Separation result of total huperzines by HSCCC in the se-lected conditions 3分离结果的高效液相色谱分析测试 图2中第3部位流份经高效液相色谱分析，其结果如图3-a所示。另外往这一流份中加入少量的石杉碱甲对照品在同样的色谱条件下进行高效液相色谱分析，其结果如图3-b所示。分析所用的色谱条件为：色谱件(Hypersil OD S 5um，4. 6mm X250mm， Agilent)；流动相 (Methano1/H，O /Triethano-lam ine =60 40 0.02，V/V/V)；流动相流速(1.0mL/min)；柱温(40.0℃)；紫外检测波长(310mm)；样品溶媒 (HPLC流动相)；样品溶液经 0.45pm微孔滤膜过滤。 图3 图2中石杉碱甲流份的确定 Fig3 Confim ing fraction part of huperzine A in Fig 2 a第3部位流份的 HPLC色谱图：b.第3部位流份稀释液+石杉碱甲对照品叠加的 HPLC色谱图 以上的分析结果说明图2中对应的第3部位流份的主成分为石杉碱甲，且其在相应的 HPLC色谱条件下，除主成分峰外在 20min内未显示出杂质峰并与对照品在相同的色谱条件下具有相同的高效液相色谱峰特性。另外经过对照品外标法定量测定，本实验所得的石杉碱甲产品纯度为98.6%且高速逆流色谱工艺的目标成分回收率为81.3%。 4 结论 利用选定的溶剂体系—n-Hexane-n-BuOH-H，O(4：1：5)及优化后的高速逆流色谱工艺参数(700RPM正向洗脱、2mL/min及 45℃)，在分析与半制备型高速逆流色谱仪上，从千层塔植物提取物中分离制备获得了石杉碱甲单体。工艺的分离周期较短、产品纯度高、分离量较大，而且经实验验证工艺的稳定性较高。 (上接第286页) ( [16] Westphal GA， S chnuch A， Schulz TG， etal Homozygous genedeletions of the glutathione S-transferasesM1 a nd Tl a r e a s sociated with thimero sal sensitizat i on [ J] . I n t Arch Occu p Environ Health， 2000，73(6)：3 8 4-388. ) ( [17] K awagishi Y，Mita H，TaniguchiM， et al L e ukotriene C4 synthasepromoter polymoiphism i n J a panese patients with a s pirin-induced asthma [J ] . Allergy Cl i n mmunol，2002，109(6)：936-942. ) ( [18] P imohamedM， Li n K， Chadwick D， et al T N F-abha promoterregion gene p olymoiphisms in ca r bamazep ine-hypersensitive pa - tients [ J ] . Neurology ， 2001 ， 56(7)：890-896. ) ( [ 1 9]J u LY， Pao l ozziL， Delecoeuillerie G ， e t al A possible linkage ofHLADRB hap l otypes with Tiopronin i n tolerance in rheumatoid arthriti s [J]. Clin Exp Rheumatol， 1994， 1 2(3)： 2 49-254. ) ( [ 2 0] M allal S ， Nolan D ， Witt C， et al A s sociation b e tween presenceof HLA B * 5701， HLADR7， and HLA DQ3 and hyp e rsensitivity to HⅣ-1 r e verse-transcrip tase i nhibitor abacavir [J ] . L a n cet， 2002，359(9308)：727-732 ) ( [21] N aisbitt D J， F arrell J， Wong G， e t al Ch a racterization o f drug- specific T cells in lamotrigine h ypersensitivity [ J ] . A llergy Clin ) ( 中国现代应用药学杂志2006年8月第23卷第4期 ) ( [1] I to Y. E fficient preparative countercurrent chromatography with acoil p lanet centrifuge [ J ]. J Chromatogr， 1981. 161-1 7 0. ) ( [2] 袁黎明，傅若农，张天佑.高速逆流色谱在植物有效成分分离 中的应用[J].药物分析杂志，1998，18(1)：60-64. ) ( 张天佑. 逆 流色谱技术.北京：北京科学技术出版社，1991. ) ( A shani Y， P eggins JO， D o ctor BP. M ec hanism of inhibition ofcholinesterase s by huperzin e A [J ]. B io Chem Bio P hys R es Comm， 1 9 92， 184(2)：719-726. ) ( [5] Saxena A， QianN， K o vach-IM， Kozikowski-A-P， et al Id en ti- fication of amino a cid r esidues i nvolved in the b i nding of Hu- perzine A to cholinesterases[J]. . P rotei n Sc i ， 1994，3(10)： 1770-1778. ) ( [6] 孙远明，余红英，杨跃生，等.HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱 甲含量[J].中草药.2002 ， 33(12)：107 8 -1080. ) ( [7 ] ： 袁珊琴，冯锐，顾国明.蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅱ) [J].中草药，1994，25(9)：453-454. ) ( [8] Liu JS， Z hu YL， C h ao MY， et a l The stru c tures of huperzine A and B ， t w o new al k aloids exhibiting marked anticholiesterase ac-tivity [J]. Can J Chem， 1986，6 4 ：837-839. ) ( [9] 刘嘉森，俞超美，周有作，等.石碱甲和石杉碱乙的化学研 究[J].化学学报，1986，44：1035-1040. ) ( [10]沈生荣，于海宁，金超芳，等.石杉碱甲提取工艺研究[J].浙 江大学学报.2002，28( 6 )：591-595. ) ( [11]张秀尧，王惠康，齐一萍.蛇足草(千层塔)的化学成分研究 [J].中草药.199 0 ，21(4)：2-4. ) ( [ 1 2] Camp iani Giuseppe， kozikowski A la n P， Wang SM. et al Syn-thesis a nd anticholinesterase a c tivity of h u perzine A an a loguescontaining p heno and ca t echol re p lacements fo r the pyridine ri n g [J]， B ioorg Med Chem Lett， 1 998，8(11)：14 1 3-1418. ) ( [13] Kaneko S， Nakajijm AN， S hikano M. et al ! S S ynthetic s tudies ofhuperzine A and its f l uorinated a nalogues 2. Synthesis and acetycholinesterase i nhibitory activity of n o vel fl u orinated hu-perzine A analogues [J ]. Tetrahedro n ， 1998，54(2 1 )：5485- 5506. ) ( 收稿日期：2005-05-20 ) ( mmunol， 2 003，111( 6 )：1393-1403. ) ( [22] YawalkarN， Hunger RE， B u ri C， et al A comparative study ofthe expression of c ytotoxic pioteins in allergic contact dematitisand p soriasis： s pongiotic skin l esions in allergi c contact dematitisare highly i nfiltrate d by T cells exp ressing perforin an d granzyme B [J]. P athol， 2001，158(3)：8 0 3-808. ) ( [23] P o sadas S J ， P a dial A ， To r res MJ， et al Delayed rea c tions todrug s how l evels of perfins， granzyme B， and FasL t o b e r elated to disease severity [ J ]. A llergy Clin mmunol， 2002，109： 1 5 5- 161. ) ( [24] Abe R ， Shim izu T ， S hibaki A， e t a l Toxic epidemmal n eciolysisand S tevens-Johnson syndrome are i n duced by so l uble Fa s ligand [J ] . Pathol， 2003，162(5)： 1 515-1520. ) ( [ 2 5] Pichler WJ. Pr ed ictive dru g allergy tes t ing： an alt e mnative vie w - point [J]. Toxicology ， 2001，158(1-2)：31-41. ) ( [26] NaisbittDJ， VilarJ， S t alford A ， e t al P lasma cysteine d eficiencyand d ecreased reduction of nitro so su lp ham ethoxazo le with HⅣ i n- fectio n [J]. A DS Res Hum Retrov ， 2000，16：1929-1938. ) ( 收稿日期：2005-01-19 ) ·Chin JMAP， August， Vol Na ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net