植物油 花生油、大豆油、玉米油、葵花籽油食用油中苯并芘检测方案(生化耗材)

应用文集 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 用户投稿 采用 Bond Elut ENV 及 Bond Elut Si 固相萃取柱快速提取净化食用植物油中苯并芘 作者 前言 何强陕西出入境检验检疫局 由于苯并芘与食用植物油互溶性好，难以有效分离，食用植物油中苯并芘的检测一直是个难题，相关的检测标准及方法使用起来也都存在一些问题。目前食用油中苯并并测定时样品前处理方法主要有三种，第一种是用溶剂直接萃取或皂化后萃取，再用C18和硅酸镁固相萃取柱、硅胶基固相萃取柱、凝胶渗透色谱法净化，第二种是用石油醚等溶剂将样品溶解后，用氧化铝层析柱净化，第三种是将食用油溶解后直接进样测定。其中第一种方法操作复杂、耗时长、成本高，而且回收率不够理想，需要采用内标法定量，第二种方法氧化铝层析柱对油脂的去除效果有限，称样量不能高于0.4g， 否则不能有效去除油脂，而且试剂消耗量大、耗时长，第三种方法样品未经净化，测定时干扰大、灵敏度低，而且对色谱柱及仪器系统有较大的损坏。 Bond Elut ENV 固相萃取柱填料是一种新型的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，我们使用该固相萃取柱时发现，苯并芘在一定条件下能够在该柱上有良好的保留，而且操作简便、快速、成本较低，使用该固相萃取柱提取净化油脂中苯并芘尚未查到相关的文献报道，我们选择简便常用的液相色谱-荧光检测法结合 Bond Elut ENV固相萃取柱对食用植物油中苯并芘残留量进行了快速检测，取得了良好的效果。 对成分较复杂的芝麻香油样品选择 BondElut Si 串联 Bond Elut ENV固相萃取柱净化，净化效果良好。 样品前处理 试剂：正己烷、二氯甲烷、乙腈：均为色谱纯。 称取0.5g食用植物油试样(精确到0.001g)，加入3mL正己烷，涡旋溶解，待净化。 SPE 净化过程 1.花生油、大豆油、玉米油、葵花籽油、稻米油、胡麻油、调和油、菜籽油 活化 4mL正己烷 上样 样品溶液及2mL样品管洗涤液 淋洗5mL正己烷 洗脱 4mL二氯甲烷 将收集的洗脱液于40℃旋转蒸发至干，用 1.00 mL乙腈超声溶解 整个固相萃取过程流速保持约1mL/min，重力自流。 Bond Elut Si 500 mg， 3cc (P/N 14102037) Bond Elut ENV 500 mg， 6cc (P/N 12255011) 将 Si柱串接在ENV 柱上方 活化 5mL正己烷 上样样品溶液及2mL样品管洗涤液 淋洗 5mL正己烷 弃去上端的 Si 固相萃取柱 ENV 柱待洗脱 洗脱 4mL二氯甲烷 将收集的洗脱液于40℃旋转蒸发至干，用1.00 mL乙腈超声溶解 液相色谱条件 流动相：乙乙-水(95+5，体积比)； 色谱柱： Pursuit PAH， 250×4.6 mm， 5 pm (PN.A7000250X046)流速： 1.5 mL/min； 荧光检测条件： 激发波长：297nm， 发射波长：408nm；或激发波长：384nm，发射波长：406nm； 进样量： 20pL。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 用户投稿 (采用激发波长297 nm，发射波长408 nm 时的标准溶液、空白及样品色谱图。) 图1液相色谱图。1.苯并芘标准溶液(10ng/ml)；2.样品空白；3.花生油； 4.大豆油；5.玉米胚芽油；6.葵花籽油；7.稻米油；8.胡麻油；9.坚果调和油；10.菜籽油；11.芝麻香油 线性范围及检出限 线性范围：1.0ng/mL~50.0 ng/mL 线性相关系数： r=0.9996； 检出限：0.3pg/kg (S/N=3)； 测定低限(定量限)：1.0 pg/kg (S/N=10)； 加标回收率结果 选择花生油、玉米胚芽油、菜籽油、芝麻香油为样品基质，进行加标回收率实验，根据方法测定低限、限量要求、样品本底含量等情况确定加标水平，加标水平必须包括我国 GB2762-2005 规定的限量水平(即10.0 pg/kg)， 尽可能的包括测定低限水平(即1.0 pg/kg) 和样品含量附近水平，但由于样品含量高时，添加水平如果太低，则回收率结果受样品本身含量测定偏差的影响太大，统计回收率已无意义，所以规定样品本底含量低于3 ug/kg，加标水平为1.0、5.0、10.0pg/kg，样品本底含量在3~6 pg/kg时，加标水平为2.0、5.0、10.0 ug/kg，样品本底含量大于6 ug/kg时，加标水平为5.0、10.0、20.0 pg/kg， 每个加标水平6平行， 具体回收率情况见表1。 结果讨论 1.不同基质样品净化条件选择 在样品的检测过程中发现，仅采用 Bond Elut ENV固相萃取柱净化时，芝麻香油的加标回收率偏低，而且净化效果不好，经考察，在Bond Elut ENV固相萃取柱上端串联一硅胶固相萃取柱，可以有效的改善净化效果，加标回收率也显著提高。芝麻香油样品单独采用Bond Elut ENV 净化时加标回收率为61.9%、57.8%，而采用串联柱净化时回收率为77.4%、90.9%。芝麻香油用 Bond Elut ENV固相萃取柱净化及采用串联固相萃取柱净化的液相色谱图如图2A所示，净化效果显著改善。其他植物油样品采用串联固相萃取柱净化时，净化效果也有提高(如图2B)，但去除的主要是苯并[a]芘出峰位置以前的杂质，对苯并[a]芘出峰位置的色谱分离无显著影响，加标回收率也未有明显改善，从使用方便及节省成本的角度考虑，其他植物油不采用串联固相萃取柱净化。 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 表1植物油中苯并芘的添加回收率及精密度数据 样品名称 加标水平(pg/kg) 回收率范围(%) 平均回收率(%) 精密度(%) 5.0 76.3~103.6 87.2 11.9 花生油 10.0 77.4~99.7 86.8 9.3 20.0 79.5~99.0 89.0 8.1 1.0 76.9~95.4 84.4 8.2 玉米胚芽油 5.0 77.8~98.1 87.2 8.1 10.0 79.4~100.6 88.0 8.4 1.0 76.5~99.6 86.2 9.9 菜籽油 5.0 77.6~97.9 86.9 8.3 10.0 78.4~99.6 87.9 8.2 2.0 76.4~100.3 85.2 10.2 香油 5.0 78.4~99.8 87.5 8.3 10.0 79.3~101.2 88.7 8.5 图2香油样品(A)和菜籽油样品； (B)采用不同净化方法时的液相色谱图 a： 采用 Bond Elut ENV 固相萃取柱净化；b：采用 Bond Elut Si 串联 Bond Elut ENV 固相萃取柱净化： 引领分分科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 2. Bond Elut ENV 固相萃取柱与与 HLB 固相萃取柱净化效果的比较 实验中采用同样的处理步骤比较了 HLB 和 Bond Elut ENV 两种小柱的净化效果，两种小柱分别测定3次的加标回收率均能达到75%以上，回收率无显著差异，但采用 HLB 柱净化后样品色谱图上杂质峰较高，色谱基线不稳定，如图3所示，可能是由于 HLB固相萃取柱的吸附性更强，对苯并芘和杂质均有强的吸附，淋洗时杂质没有被有效的淋洗下来，造成净化效果不理想。 图3分别采用 HLB (a) 和 Bond Elut ENV (b) 固相萃取柱净化后的菜籽油样品液相色谱图 3.方法的应用及效果 利用建立的快速处理方法共检测市售食用植物油样品105 批， 包括花生油、大豆油、玉米胚芽油、葵花籽油、稻米油、胡麻油、调和油、菜籽油、香油等样品，检测时均无干扰，色谱分离良好(如图1)， 有3批含量超过 10pg/kg， 对超过 10 pg/kg 的样品采用国家标准GB/T 22509-2008 规定的方法进行了复测，检测结果与采用本快速方法的结果一致，证明本快速方法准确可靠、适用性强。 本方法利用 Bond Elut ENV固相萃取柱提取净化食用植物油中的苯并芘，获得了良好的效果，整个净化过程耗时不超过 20 min，试剂消耗量不超过20 mL， 并且可以同时处理多个样品；而常用的提取后用凝胶渗透色谱净化的方法耗时超过150 min， 试剂消耗量超过200mL， 而且凝胶渗透色谱仪价格昂贵；另一种常用的氧化铝层析柱净化的方法，耗时超过 100 min， 试剂消耗量超过120mL. 本方法简便、快速、成本低，加标回收率及重现性满足痕量成分检测要求，有较大的推广应用前景。 WWW.AGILENT.COM/CHEM/SAMPLEPREP：CN 捷伦样品制备选择指南及应用文集 加标回收率结果选择花生油、玉米胚芽油、菜籽油、芝麻香油为样品基质，进行加标回收率实验，根据方法测定低限、限量要求、样品本底含量等情况确定加标水平，加标水平必须包括我国GB2762-2005 规定 的限量水平（即10.0 μg/kg），尽可能的包括测定低限水平（即 1.0 μg/kg）和样品含量附近水平，但由于样品含量高时，添加水 平如果太低，则回收率结果受样品本身含量测定偏差的影响太大，统计回收率已无意义，所以规定样品本底含量低于3 μg/kg，加标 水平为1.0、5.0、10.0 μg/kg，样品本底含量在3 ~ 6 μg/kg 时，加 标水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，样品本底含量大于6 μg/kg时， 加标水平为5.0、10.0、20.0 μg/kg，每个加标水平6 平行，具体 回收率情况见表1。