血液中氨基酸和酰基肉碱检测方案(液质联用仪)

1.3 使用LCMS-8050 衍生化法测定 DBS 中的氨基酸和酰基肉碱 摘要：本文介绍了以衍生法作为前处理，使用三重四极杆色谱质谱联用仪测定干血斑中的氨基酸和脂酰肉碱的方法。本方法灵敏度高，分析时间短，使用岛津专用新生儿筛查软件Neonatal Solution 自动得到各组分的定量计算结果，同时根据预设的限值，自动标注超出限值的结果。 关键词：氨基酸 脂酰肉碱 新生儿筛查 在新生儿筛查中高效液相色谱-三重四极杆串联质谱技术(LC-MS/MS)主要应用于血液中氨基酸、酰基肉碱两类化合物的检测。进行新生儿遗传代谢病筛查的血片(Dried Blood Spot，DBS)经过相应的前处理后置于96孔板中直接在液相色谱串联质谱仪中分析得到检测结果(流程如图1所示)。 样品的前处理方法一般分为衍生化法和非衍生化法两大类，本文为您介绍对血片进行衍生化处理后，使用岛津LCMS-8050 进行检测的方法。 图1.LCMSMS 进行新生筛筛查工作的一般流程 血片采集 采集干血样本需要熟练的采集、处理及运输技术。涉及新生儿样品，其采集技术见 CLSI文件 LA4-A5.中国地区请参考《新生儿疾病筛查技术规范(2010版)》中《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》。血样直接采集到滤纸上，滤纸应与试剂盒质控品所使用的滤纸一致。 衍生化方法 衍生化法是指使用盐酸正丁醇(3mol/L)作为衍生试剂进行前处理的方法。盐酸正丁醇由正丁醇和乙酰氯按照体积比 9：1， v/v 进行配制。目前衍生化法多参考 Zytkowicz 等报道的方法，一般按照如下具体步骤进行操作：使用打孔器在血片滤纸上切取直径3mm 的干血滤纸片，置于96孔过滤板中，每孔加入100uL 含有同位素内标的甲醇溶液，室温放置20 min，将萃取液离心至96孔聚丙烯板，55℃加热吹干，再加入60 uL 盐酸正丁醇， Teflon 膜覆盖， 置65℃恒温箱内15 min， 随后55℃加热吹干，再加入100 uL 80%乙腈，铝膜覆盖后即可进行串联质谱检测。 经过衍生化反应后目标化合物与盐酸正丁醇反应生成丁酯化氨基酸或丁酯化化酰肉碱，图2和图3分别以 Phe 和 C14 为例说明氨基酸和酰基肉碱的衍生化反应过程，图4为衍生化流程。 图2.氨基酸衍生化反应 图3.酰基肉碱衍生化反应 图4.衍生化前处理流程 仪器分析条件和离子流图 处理后的样品采用自动进样器进样，进样量1uL，进样后无需使用色谱柱进行分离，直接进入质谱检测，1 min 内即可完成一次样本分析。在待测样品中添加相应同位素内标，根据目标化合物与对应同位素内标峰面积或峰高的比值进行目标化合物的定量计算，本文采用多反应检测方式(MRM)采集数据。流动相采用乙腈：(0.02%甲酸水溶液)=80：20， 流速时间程序和质谱条件分别如如表1和表2所示，部分氨基酸和酰基肉碱的离子流图如图5所示。 表1.流速时间程序 Time Module Command Value 0.10 Pumps Total Flow 0.05 0.65 Pumps Total Flow 0.10 0.66 Pumps Total Flow 1.00 1.00 Controller Stop 表2.质谱条件 分析仪器 LCMS-8050 碰撞气 氩气 离子源 ESI(+) Interface 温度 300℃ 离子源接口电压 4.5KV DL管温度 250℃ 加热气 空气8 L/min HB温度 400℃ 雾化气 氮气 2L/min 扫描模式 多反映监测(MRM) 干燥气 氮气10 L/min 驻留时间 10 ms C5DC Leu Met (x100，000)1.25-32：174.10>72.10(+) 1.00-0.75-0.50-0.25 0.00- (x100，000)-16：188.10>86.10(+) 3.0-2.0-1.0-0.0- 0.0 0.5 TT 9圆凿‘身聶吊群半半身秋 凿影陋业蝎丝‘削秋妍群凿影孕辛提‘中í°凿身吊群丝号中““催鲁号质‘少明牌工 suounfosqeT‘T uounos [eneuoeN 凿曾唑uounosIejeuoN 园士验提‘S A C D E F G H I 1 Neonatal Solution 2 3 Analysis Time 2015/02/13 4 5 Date Acqui Tray：Vial Ala Are Asp Glu Gly Leu 6 Criteria Upper Limit (Caution) 一 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 7 Criteria Upper Limit (Notice) - - 90.00 90.00 90.00 90.00 90.00 90.00 8 Criteria Lower Limit (Notice) 一 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 9 Criteria Lower Limit (Caution 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10 c1 2/13/2015 1：2 626 0.24 63.01 2.46 2.64 2.99 11 c2 2/13/2015 1：3 33.56 4.04 149.44 29.66 22.94 10.70 12 ns 2/13/2015 1：4 4.85 0.25 27.03 6.70 5.75 3.13 1口 1口 图6.样品结果 K