多烯酸乙酯软胶囊中抗氧化剂检测方案(液相色谱柱)

中国生化药物杂志2015年第5期 总第35卷生化药物技术 多烯酸乙酯软胶囊的抗氧化剂研究 任丽萍，蔺娟，闵祺'，廖海明'，杨洪淼'，范慧红^ (1.中国食品药品检定研究院，北京100050；2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆乌鲁木齐830004；3.辽宁锦州市食品药品检验所，辽宁辽州1210000) [摘要] 目的 分析比较国内外同类产品的过氧化值、甲氧基苯胺值以考察其氧化稳定性。方法 采用 TSK gel ODS-100V 色谱柱(250 mm×4.6mm，5 p.m)，流动相为甲醇一水(98∶2，V/V)测定多烯酸乙酯软胶囊样生中维生素E的结构形式；初步评价生育酚醋酸酯、α-生育酚作为辅料对ω-3多不饱和脂肪酸乙酯类药物抗氧化作用的影响。结果 国产样品中添加的抗氧化剂的主要结构形式为醋酸酯结构，国外同类样品抗氧化剂主要为游离的α-生育酚；生育酚醋酸酯的抗氧化效果不如生育酚的效果佳，维生素E的结构形式对 w-3多不饱和脂肪酸乙酯类药物抗氧化作用有直接影响。结论 本研究为科学评价多烯酸乙酯软胶囊中药物抗氧化剂添加的合理性提供了依据，对有效控制该类药品质量具有积极意义。 [关键词] 多烯酸乙酯软胶囊；抗氧剂；抗氧化作用；维生素E；α-生育酚；生育酚醋酸酯 [中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1005-1678(2015)05-0000-00 Study on antioxidant of ethyl polyenoate soft capsules REN Li-ping， LIN Juan’， MIN Qi， LIAO Hai-ming'， YANG Hong-miao， FAN Hui-hong (1.National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China； 2. Xinjiang UyghurAutonomous Region Institute for Food and Drug Control， Urumqi 830004， China；3. LiaoningJinzhou City Institute for Food and Drug Control， Jinzhou 121000， China) [Abstract] Objective To analysis peroxide value and anisidine value of ethyl polyenoate soft capsules and imported drugs and evaluate theoxidative stability. Methods The analysis was carried out on a TSK gel ODS-100 V(250 mm×4.6 mm，5 pm) with methanol-water(98：2，V/V)as themobile phase to determine the structure of the vitamin E as antioxidant. The influence on the antioxidation effect of tocopherol acetate and o-tocopherol asexcipient in omega-3 polyunsaturated fatty acid ethyl ester drugs was evaluated. Results The structure of vitamin E as antioxidant in domestic drugs wasacetate， while vitamin E as excipient in foreign drugs had the structure of a-tocopherol monomer. As antioxidant， the antioxidation effect of tocopherolacetate was better than o-tocopherol. The structure of vitamin E had a direct impact on the antioxidation effect of omega-3 polyunsaturated fatty acid ethylester drugs. Conclusion The studies provide the basis for evaluating rationality of antioxidant in ethyl polyenoate soft capsules scientifically， which haspositive significance for controlling the quality of the drug effectively. [Keywords] ethyl polyenoate soft capsules； antioxidant； antioxidation effect； vitamin E； a-tocopherol； tocopherol acetate 多烯酸乙酯软胶囊为 ω-3多不饱和脂肪酸乙酯类降脂药，其原料和制剂均为《中国药典》2010年版二部新增品种。该药为国家非基本药物，在部分地区医保目录乙类品种中收载。美国药典(usp37)收载同类品种ω-3多不饱和脂肪酸乙酯类原料和软胶囊剂，日本药局方(JP16)收载同类品种二十碳五烯酸乙酯原料药，欧洲药典(EP8.0)收载同类品种w-3多不饱和脂肪酸乙酯60、90系列原料药。2014年我院承担了对多烯酸乙酯软胶囊的国家评价性抽验工作。 ω-3多不饱和脂肪酸乙酯类药物的主要有效成分为二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯，2者化学结构中均含有较多 ( 作者简介：任丽萍，女，硕士，副主任药师，研究方向：生化药品质量研究，E-mail：pplucky@126. com；范慧红，通讯作者，女，博士，研究员，研究方向：生 化药品质量研究，E-mail：shenghuayaoshi@ 126. com。 ) 的不饱和双键，在加工和运输过程中易受到氧气、光照和水分等因素的作用而发生酸败12-3]。因此氧化稳定性是衡量该类药品质量的重要指标，药品中添加的抗氧化剂又与药品的氧化稳定性紧密相关。《中国药典》2010年版药典注明该药处方由多烯酸乙酯原料和适量稳定剂组成，但未对稳定剂种类和量有更详细的说明。在调研过程中发现，国内企业添加的稳定剂主要为维生素E，各企业的添加量存在较大差别，浓度范围大约为0.5%~3%。该添加量远远高于国外同类品种所标明的0.1%~0.4%浓度，与多烯酸乙酯软胶囊所不同的是，国外品种所添加的抗氧剂为α-生育酚。 维生素E是一种脂溶性的维生素，由于取代基位置的不同存在α、、y、科四种异构体，根据酚羟基是否酯化可分为生育酚与生育酚醋酸酯[4]，中国药典中收载的维生素E就是以醋酸酯的形式存在。多烯酸乙酯软胶囊药品所使用的抗氧化剂维生 素E是何种结构形式?它与国外药品使用的α-生育酚有何区别?2者对该类药品的氧化稳定性有何影响??二者的抗氧化作用哪种更强?针对以上问题，本研究在对国内外同类药品的氧化稳定性指标过氧化值、甲氧基苯胺值结果进行比较分析的基础上，对该品种所添加抗氧剂维生素E的结构形式以及不同结构的维生素E的抗氧化能力进行考察，以上研究为科学评价该类药物抗氧化剂添加的合理性提供了依据，对有效控制该类药品质量具有积极意义。 仪器与试药 1.1 仪器 LC-20A 型高效液相色谱仪：SPD-20A检测器、SIL-20A 自动进样器、二元泵(日本岛津公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器系统有限公司)。 1.2 试药2014年国家评价性抽验的6个厂家共26批样品，维生素E辅料4批(国内4家制剂生产企业提供)，多烯酸乙酯原料样品(国内企业A提供)，二十碳五烯酸乙酯原料3批(进口企业A)，二十碳五烯酸乙酯软胶囊3批(进口企业B)，a-生育酚标准品(日本药局方)，生育酚育酸酯对照品(sigma 公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水(实验室自制)。 1.3 氧化值、甲氧基苯胺值测定方法 取多烯酸乙酯软胶囊5个企业25批次样品，二十碳五烯酸乙酯软胶囊3批样品，按照《中国药典》2010年版二部多烯酸乙酯软胶囊质量标准中过氧化值、甲氧基苯胺值方法测定，采用 SPSS 统计软件绘制各企业所有批次的过氧化值、甲氧基苯胺值箱式图。 1.4 国产制剂辅料中维生素E结构形式的考察 1.4.1 色谱条件：色谱柱：TSK gel ODS-100V 色谱柱(250mm×4.6 mm，5pm)；柱温：40℃；检测波长：285nm；流动相：甲醇：纯水=98：2；流速：1.0mL，等度洗脱。 1.4.2 对照品及供试品溶液的制备：取生育酚醋酸酯对照品、α-生育酚标准品、企业提供维生素E辅料各 50 mg，分另置于棕色50 mL 容量瓶中，加入甲醇并定容，采用0.45 p.m 针头滤器进行过滤。各样品进样20 uL。 1.5 生育酚醋酸酯与游离α-生育酚对油脂氧化影响 1.5.1 供试品的制备：模拟国外制剂处方，加入α-生育酚到多烯酸乙酯原料中，混匀后置于表面皿中，制备0.1%、0.2%的α-生育酚共2个浓度水平的多烯酸乙酯制剂；模拟国内制剂处方，加入生育酚醋酸酯到多烯酸乙酯原料中，混匀后置于表面皿中，制备1%、3%的生育酚醋酸酯共2个浓度水平的多烯酸乙酯制剂，取多烯酸乙酯原料药空白对照。 1.5.2 实验方法：将所有样品置于紫外灯下照射，照射2h(功率40w，垂直距离60 cm)，取出后置于65℃恒温烘箱中诱导氧化酸败。每隔24 h，将样品取出置于紫外灯下照射2h，然后复置于65℃恒温烘箱中继续诱导，连续照射5d，分别于第0、1、2、3、45d取样充氮保存，考察样品外观性状及过氧化值的变化。 2 结果 2.1 过氧化值、甲氧基苯胺值测定结果 所有批次样品的过氧化值均小于过15.0，甲氧基苯胺值值小于30.0。国内外不同企业样品的过氧化值、甲氧基苯胺值的箱式图分别见图1、2。从图中可以看出国内企业的过氧化值、甲氧基苯胺值均高于国外同类产品，国内同一企业不同批次间样品的过氧化值、甲氧基苯胺值均存在较大差异。 图1不同生产单位样品过氧化值箱式图 Fig. 1Comparison of peroxide value of ethyl polyenoate softcapsules from different manufactures 图22不同生产单位样品甲氧基苯胺值箱式图 Fig.2 Comparison of anisidine value of ethyl polyenoatesoft capsules from different manufactures 2.2 国产制剂辅料中维生素E结构形式的考察结果生育酚、生育酚醋酸酯对照品及供试品溶液的 HPLC 色谱图见图3。由4家企业提供的辅料其维生素E 主要结构形式为生育酚醋酸酯，进口企业样品中的抗氧化剂为α-生育酚。 图3 对照品及供试品溶液的 HPLC 色谱图 1. α-生育酚；2.生育酚醋酸酯；a.进口EPA 乙酯软胶囊；b-e.4家国内企业提供维生素E辅料；f.生育酚醋酸酯对照对；g.o-生育酚对照品 Fig.3 HPLC chromatograms of reference substance and sample solution 1. a-tocopherol；2. tocopherol acetate；a. imported ethyl icosapentate soft capsules；b-e. vitamin E as excipient supplied by four kinds of domestic manufactures ofethyl polyenoate soft capsules；f. tocopherol acetate reference substance； g. a-tocopherol reference substance 2.3 生育酚醋酸酯与游离α-生育酚对油脂氧化影响结果不同浓度水平的α-生育酚与生育酚醋酸酯对多烯酸乙酯药品性状的影响见图4，由图4可知，与第1天样品相比，第4天取样时，加入1%3%的生育酚醋酸酯的国内处方模拟组均发生明显的色变；加入0.1%的α-生育酚的国外处方模拟组产生色变，但颜色浅于对照组和国内处方模拟组；加入0.2%的α-生育酚的国外处方模拟组颜色未产生色变。加入1%、3%的生育酚醋酸酯的国内处方模拟组在实验中色变与对照组比没有明显的区别。 不同浓度水平的α-生育酚与生育酚醋酸酯对多烯酸乙酯药品过氧化值的影响见图5，由图5可知，国内处方模拟组和对照组样品在实验周期内的过氧化值一直处于上升趋势，与以上3组样品过氧化值变化相比，国外处方模拟组样品中的α-生育酚的存在减缓了样品氧化过程。 图4 不同浓度α-生育酚与生育酚醋酸酯对外观性状的影响 Fig.4 The effect of a-tocopherol and tocopherol tocopherol and tocopherolacetate with different concentrations on appearance 图5 不同浓度α-生育酚与生育酚醋酸酯对过氧化值的影响 Fig.5 The effect of a-acetate with different concentrations on peroxide value 3 讨论 3.1 影响药物氧化稳定性评价指标的选择5 油脂的氧化过程是一个比较复杂的过程。油脂的自动氧化，最先经过诱导期，在此阶段，主要生产第一级产物过氧化物；其次经过氧化期，在这一阶段，主要生成第二级氧化产物，如醇类及羧基化合物，并进一步分解物羧酸，在此期间可以检测到过氧化值、挥发性反应物及氧吸收显著增加16-8J，在此阶段，反应会比较迅速，且油脂开始劣变，此为诱导期终点。油脂的诱导期到氧化期之间时间的长短表明油脂抗氧化能力的强弱，即氧化稳定性的好坏。油脂的稳定性的评价指标种类较多，有过氧化值、脂肪酸组成、 酸值等。其中，过氧化值、甲氧基苯胺值由于具有适用范围广，测定方法简单的优点。因此在评价油脂类药物的氧化稳定性研究中被广泛应用，本研究中采用过氧化值及甲氧基苯胺值作为评价指标。 3.2 药物氧化稳定性的影响因素 与一般的鱼油保健品所不同的是，多烯酸乙酯软胶囊中不饱和脂肪酸的二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯的含量高达80%以上，因此作为药品使用的多烯酸乙酯更容易发生氧化。因此在药品的提取、精制、运输和贮藏以及进一步加工过程中，需要随时防止氧化。空气中氧气的存在是氧化的主要条件，紫外线、高温甚至金属离子是促进氧化的因素，都应尽量避免。在其他影响因素不能改变的条件下，添加合适抗氧化剂能够适当减缓多不饱和脂肪酸的氧化，但抗氧化的机理因抗氧化剂的不同而异。若由于抗氧化剂的使用不当，会造成抗氧化效果不佳，甚至比不加更坏。因此，不同企业由于原料的提纯工艺、中间体的贮存及运输条件有所不同，应根据各自工艺条件摸索适合的抗氧化剂。 氧化稳定性是w-3多不饱和脂肪酸乙酯类药物质量控制所面临的巨大挑战之一。本文采用 HPLC-UV 方法对国内外药品中抗氧化剂维生素E结构形式进行测定，并比较了以醋酸酯和游离态2种结构形式的维生素E 的抗氧化作用。研究结果表明国内药品中的抗氧化剂主要是以生育酚醋酸酯形式存在的维生素E，其抗氧化作用不如国外同类品种中使用的抗氧化剂α-生育酚的效果佳，初步作出了抗氧化剂的使用不当可能是国内药品的氧化稳定性与国外同类产品存在差距的判断，但由于已有的 HPLC-UV 方法灵敏度很低，无法准确测定国产样品中α-生育酚的含量，为进一步确证该项判断，本研究还建立了高效液相色谱-荧光检测法考察我国药品中添加的生育酚的种类和水平，该项研究结果将在其他论文中专门介绍。综合以上研究，建议国内的多烯酸乙酯软胶囊生产企业开展该品种的抗氧化剂研究，进一步改进产品处方，以提高该类品种的氧化稳定性。CP ( 参考文献 ) ( [1] 中国医药科技出版社.中华人民共和国药典2010版二部[M]. 2010：272-273，907-908. ) ( 2 边凤霞，郑旭煦，殷钟意.植物油氧化稳定性研究进展[J] . 重庆工 商大学学报(自然科学版) ， 2013，30(1)：69-74. ) ( [3] 朱英莲.南瓜籽油提取工艺优化及油脂氧化稳定性研究[J].粮食 与油脂，2015，28(1)：24-26. ) ( 4 樊明涛，吴守一，马海乐.维生素E测定方法的研究进展[J].江苏 大学学报(自然科学版) ， 2002，23(1)：54-57. ) ( [51 曹文明，王鑫，包杰，等.油脂氧化评价研究进展[J].粮食与油脂， 2013，26(4)：1-4. ) ( [6] 刘翠芳，毕艳兰，刘太宇，等. 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