机械张力对人成骨样细胞TGF_表达的影响

现代口腔医学杂志2002年第16卷第3期 JModem Stomatol， M ay 2002， Vol 16， No. 3214 机械张力对人成骨样细胞 TGF-3表达的影响 邹淑娟 胡 静 【摘要】 目的 观察机械张力对人成骨细胞 TGF-B 基因表达的影响。方法 通过 Flexercell 细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞MG- 63进行6%、12%和24%的拉伸应变加载实验，用 RT-PCR反应检测细胞受力后TGF-3mRNA的表达。结果 6%和12%的拉伸率能显著促进MG-63细胞TGF-3的表达，但24%的拉伸率作用对细胞TGF β基因表达影响不明显。结论 恰当大小的机械张力可以增加成骨细胞 TGF-β的表达，过大的应力刺激可能没有这种效应。 【关键词】 机械张力 成骨细胞 TGF-s Effects of mecha nical strain on expression of TGF-3 in human osteoblast- like cells ZOU Shujuan， HU Jing· HuaxiSchool of Stomatology， Sichuan University， Chengdu 610041 【Abstract Objective To study the effects of mechanical strain on the expression of TGF-一 in human osteoblasts.Methods Cloned MG-63 human osteoblasts were cultured， and seeded at 10/well on 6-well Bioflex cell plate. Subsequently，the cells were exposed to mechanical strain stimulation(6%， 12% and24% elongation rate) using Flexercell 3000 Cell Stret chingUnit. RT- PCR reaction was used to assess the TGF-mRNA expression in MG- 63 osteoblasts. ResultsSmRNA for TGF一increased significantly in the strained MG- 63 cells with 6% and 12% mechanical streching. 24% stretching showed little effecton the mRNA expression of TGF-B1. ConclusionThis study suggests that proper mechanical strain increase the expression ofTGF-Bin osteoblasts. However， overloading may not have this effects. 【Key words Mechanical strain Osteoblasts TGF-3 中图分类号：R782.2 文献标识码： A 牵张成骨(distraction osteogenesis)是近几年用于矫治颌骨发育不足和整复骨缺损畸形的一种新技术。目前，有关成骨细胞受机械张力作用后的生物学行为变化以及某些骨生长因子对成骨活动的调控研究是深入阐明牵张成骨分子生物学机制的关键环节。我们通过一种先进的体外细胞拉伸力学装置，对人成骨样细胞MG-63受机械张力作用后的 TGF一β基因表达进行了研究。 材料和方法 细胞培养：人克隆成骨细胞株 MG-63由美国匹兹堡大学医学中心提供，该细胞系具有成骨细胞的所有特性。选用 Ham's F一 12作为细胞培养基，内含10%小牛血清，青霉素100u/ml，链霉素10Mg/ml。 在 37C 5%C02饱和湿度下进行培养传代。调整细胞密度为 10°cell/2ml，并使之同步化生长后转移至6孔 BioFlex 特制细胞培养皿中(Flexercell International Corp， PA， USA )继续培养48小 ( 本课题受国家自然科学基金资助(编号：39970797) ) 时待用。 体外细胞牵张装置及力学刺激：本实验采用美国Flexercell 公司生产的细胞拉伸加载装置Flexercell3000 Cell Stretching Unit。 该装置加载原理是用一个真空泵抽吸由特制弹性硅胶膜制成的培养皿底部，形成负压使培养皿底部产生拉伸变形，从而使附底生长的细胞受到机械牵张。细胞所受力值大小以培养皿底部硅胶膜拉伸变率(%)表示，拉伸率越大，表示细胞所受张应力越大。将待测细胞随机分为4组，每组24孔细胞。。任选一组细胞为对照组即非加力组，加力组细胞根据力值大小随机分为6%、12%和24%组，加力时间均为24小时。 RT-PCR 反应检测细胞 TGF-3mRNA 表达：在力学刺激结束后收集细胞，用 RNA 药盒(Qiagen，Santa Clara， USA)按说明书要求提取细胞总RNA.取其中 5l进行 RT-PCR 反应， TGF-1 (27bp)上游引物序列为5-CGG CAG CTG TAC ATT GAC-3，下游引物为5'一 AGC GCA CGA TCA TGT TGG一3。GAPDH(548bp)上游引物序列为 5 GGT GAAGGT CGG AGT CAA CGG-3，下游引物为5-GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT-3。以 GAPDH 的表达作为内对照。两对引物均由美国生命技术公司合成。 PCR扩增条件为：94C 60 秒， 62C 40 秒， 72C 60秒，共进行30个循环，取 10MlPCR 产物在2%琼脂糖凝胶上电泳观察。 结 果 MG一63 细胞的TGF-3mRNA 表达结果见图1.可以看出， TGF- 在对照组细胞有一定程度的表达，细胞受6%和12%的拉伸率作用24小时后，其TGF-B表达明显增加，但24%的应力刺激几乎没有导致 TGF-3 的表达增强。各组24孔细胞电泳结果经多功能凝胶成像仪定量分析结果如图2所示。PCR扩增带相对吸光值统计学分析显示6%和12%加力组与对照组和24%加力组分别比较有统计学差异(P<0.05)，但24%加力组与对照组0%)的 TGF-表达水平无统计学差异(P>0.05)。 图1 各组细胞 TGF-BmRNA 表达电泳结果 图22各组细胞 TGF-3相对表达水平比较 讨 论 牵张成骨的组织再生和修复机制非常复杂，骨生长因子在这一过程中可能起着非常重要的调控作用。 TGF-β是一种多肽生长因子，可由多种细胞合成，但在骨组织中含量最丰富，其受体在成骨细胞的表达也最多，表明TGF-3的重要作用是调节骨的生长和代谢。目前，关于 TGF-3对牵长成骨的调控机理并不清楚，但过去的研究报告显示 TGF-3 参与了这一过程。Mehrara经体内实验研究发现TGF-B 基因表达在大鼠下颌牵张的第4天达峰值，以后逐渐下降，4周时已恢复到原来水平。Zhuang等的体外实验结果显示机械张力能够促进小鼠MC3T3 成骨细胞的增殖和 TGF-3 mRNA 的表达，但作者同时认为张应力的促细胞增殖效应并不完全依赖于TGF一3的作用。Gosain3的实验还发现张应力与外源性 TGF-3合并作用反而抑制 MC3T3 细胞的增殖。Cillo4等最近通过 Flexercell 细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞Saos-2进行12%张应力刺激，发现细胞受力8、16和24小时后TGF-3mRNA表达均增加，但未对不同力值大小的刺激对 TGF一3表达的影响进行研究。细胞生物力学研究结果受许多因素影响，包括加力装置，细胞种类和刺激条件等，对细胞施加力值的大小是个不可忽视的因素。本实验选择三种不同大小的机械张力对MG-63成骨细胞进行加载实验，结果发现6%和12%的机械牵张能够明显增加细胞TGF一β的基因表达，但24%的应力作用效果不明显，说明成骨细胞对张应力的生物学反应可能与所受力值大小有关，只有恰当的力学刺激才能有效地促进成骨细胞 TGF一3的表达，过大的应力作用反而不利于细胞发挥潜在的分子生物学活性。 (本研究得到美国匹兹堡大学牙学院 Michael. J. Buckley 和 SudhaAgaiwal 教授的指导和帮助，特此致谢。) ( 参 考 文 献 ) ( 1 Mehrara BJ， R o we NM ， Steinbrech DS， et a l . Rat man d ibular dist r actionosteogenesis. Part Ⅱ. Molecular analysis of transfomming growth factor beta - 1 a n d osteocalcin gene expression. Plast Reconstr Surg， 1999，103 ( 2)： 536. ) ( 2 Zhuang H ， W ang W ， Ta h emia D. e t a l . M echanical s t rain- induced proliferatio n of osteoblastic ce l ls paral l els incre a sed TGF - B1 m RNA. Biochem B iophys Res Commun， 1 9 96， 229(2)：449. ) ( 3 Gosain AK， Song IS， Santoro T， et al. Ef f ects of transforming growth factor一β a n d mechanical strain on osteoblast cel l counts. An in vitro model for distraction osteo gensis. Pl a st Reconstr Surg 200 0 ，105 ( 1)： 1 30. ) ( 4Cillo JE， Gassner R. K oepsel R R ， et al. Growth fa c tor and cy t okine gene expression in mechanically s trained human o s teoblast - l i ke c e lls. Implication f or distract ion osteogenesis. O ral Surg Oral M ed Oral P athol， 2000，90(2)：147. ) ( (本文编辑 王植三) (收稿日期 2001-05-21) ) ?作者单位都Rcacc学华西腔医学院ectronic Publishing House. All rightsresery http：//www.cnki.net